[發明專利]一種歐文氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201711158446.7
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN108130376B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發明（設計）人: 陳償;楊藝瀅;丁雄祺;謝媚;李紅梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;胡素麗

本發明公開了一種歐文氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和檢測試劑盒。該檢測引物組為：前外引物F3：5’?CATACAGCTCTGCGTCTG?3’；前內引物FIP：5’?GCGG ATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA?3’；后內引物BIP：5’?GCCAAGGCCGTGTA GTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA?3’；前環引物LF：5’?CGGAATTGCAGACATTAC GC?3’；后環引物LB：5’?CTCTGCAGGTACTGGTAACC?3’。本發明的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法具有特異性強，操作方便簡單，檢測時間短等優點，其反應過程不需要昂貴的儀器設備，反應結果可視化，直接通過肉眼觀察即可判斷，適合于現場快速檢測的推廣使用。

技術領域：

本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種歐文氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術：

歐文氏弧菌(Vibrio owensii)是海洋中一種具有強毒力的腸道病原菌，可引發對蝦急性肝胰腺壞死癥，也可誘發錦繡龍蝦在葉狀幼體時期快速病變死亡，同時也是薔薇珊瑚的致病菌，可感染珊瑚，導致珊瑚白化死亡。關于歐文氏弧菌致病以及如何檢測防治的報導并不多見，早期對歐文氏弧菌的檢測方法只是停留在一些比較傳統的微生物分類鑒定以及傳統的PCR檢測技術。近期，關于歐文氏弧菌的檢測方法有了新的進展，等溫重組聚合酶擴增法，可以準確快速的檢測出歐文氏弧菌，但此法需要用等溫擴增熒光檢測系統來檢測和記錄熒光信號的變化，而往往野外基層現場檢測需要快速簡便的方法，盡可能避免使用昂貴的儀器設備和繁瑣的操作過程。

環介導等溫擴增(loop-mediated isothemal amplification,LAMP)技術是2000年，Notomi等開發的一種恒溫核酸擴增方法。其主要特點是，LAMP引物設計主要針對靶基因的6個不同區域，設計4條特異性引物，部分軟件經過改進后可以設計6條特異性引物，從而加速了核酸在反應中的合成速度。DNA模板在鏈置換型DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的作用下，于65℃恒溫擴增30-60min，便可合成大量核酸，具有操作簡便、快速、特異性強、結果可肉眼判斷等優點，具有很廣闊的應用前景。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種特異性強、操作方便簡單、無需昂貴的儀器設備的歐文氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和檢測試劑盒。

本發明利用環介導等溫擴增技術，以歐文氏弧菌的pryH基因(Genebank登錄號為GU111253.1)為特異靶基因，設計、篩選并優化特異性引物，建立一種LAMP檢測方法，并優化反應條件，在反應過程中添加陽性對照組和陰性對照組，并通過鈣黃綠素顯色法和凝膠電泳分析檢測樣品組和其他兩組對照的擴增產物來判斷樣品中是否含有歐文氏弧菌，以達到方便簡單，經濟快速而且靈敏的檢測效果，進而實現本發明的目的。

本發明的第一個目的是提供歐文氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物組，所述的檢測引物組如下所示：

前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

前內引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

后內引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQ IDNO.4所示)；

前環引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

后環引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQ ID NO.6所示)。