[發明專利]用于檢測NK細胞活性的試劑盒

在審

• 申請號: 201711153302.2
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107782656A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 于修鑑
• 申請（專利權）人: 廣州大年生物科技有限公司
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙)44387
• 代理人: 顏春艷

1.一種用于檢測NK細胞活性的方法，包括步驟：

(1)取3ml肝素鈉抗凝的外周血與PBS緩沖液按照1:1稀釋，將稀釋后的標本緩慢注入具有2ml淋巴細胞分離液的10ml離心管中，以665g轉速離心20min，吸取中間白細胞層；采用PBS清洗2次，然后以393g轉速離心10min，去上清液；將500μlRPMI1640培養液加入離心得到的沉淀中，混勻，得到單個核細胞PBMNC，濃度調節為1*106/ml備用；

取對數期的K562-EGFP細胞用PBS洗2次，然后以393g轉速離心10min，去上清液，加500μlRPMI1640培養液混勻，放室溫靜置1h，濃度調節為1*105/ml備用；

(2)將100μlK562-EGFP加入對照管中；將100μlPBMNC+100μlK562-EGFP加入檢測管中；然后將對照管與檢測管均放入5％CO2培養箱中孵育2h；

(3)將5.520μl抗體7-AAD-percp-cy5.5加入對照管與檢測管中，充分混勻，靜置1分鐘，然后采用流式細胞儀檢測細胞活性。

2.根據權利要求1所述的一種用于檢測NK細胞活性的方法，其特征在于，在采用流式細胞儀檢測細胞活性前需要調整其電壓，調整電壓的步驟為：將100μlPBMNC加入A管中；將100μlPBMNC與100μlK562-EGFP加入B管中，然后將A管與B管均放入5％CO2培養箱中孵育2h；將5.520μl7-AAD-percp-cy5.5加入A管中，充分混勻，靜置1分鐘。

3.根據權利要求1所述的一種用于檢測NK細胞活性的方法，其特征在于，對照管與檢測管中細胞的流速限制在200-800個/s，收集P1門內細胞至少10000個。

4.根據權利要求1至3中的一個所述的一種用于檢測NK細胞活性的方法，其特征在于，在采用流式細胞儀檢測得到的結果中，對照管中Q2門內細胞代表K562-EGFP細胞在試驗過程中自身凋亡的細胞數，Q2+Q4門內細胞代表K562-EGFP細胞總數，Q2/(Q2+Q4)代表自身K562-EGFP凋亡比例，采用A表示；檢測管中Q2門代表被NK細胞殺傷及自身凋亡的K562-EGFP細胞總數，Q2/(Q2+Q4)代表總的K562-EGFP凋亡比例，采用B表示；

檢測出的NK細胞活性＝100*(B-A)％。

5.根據權利要求4所述的一種用于檢測NK細胞活性的方法，其特征在于，正常人NK細胞活性在3.9％至19.5％，當檢測出的NK細胞活性與正常人NK細胞活性兩者之差小于3.9％時，檢測結果為NK細胞活性降低；當兩者之差大于19.5％時，檢測結果為NK細胞活性增強。

6.一種用于檢測NK細胞活性的試劑盒，其用于實施權利要求1-5中任一項所述的方法，所述試劑盒包括盒體、盒蓋和設置在盒體內的襯墊，所述襯墊上設有小孔，裝有PBS緩沖液的試劑管、裝有淋巴細胞分離液的試劑管、裝有RPMI1640培養液的試劑管、裝有熒光染料EGFP的試劑管、裝有抗體7-AAD-percp-cy5.5的試劑管、裝有熒光染料的載體pEGFP-N1質粒的試劑管被設置在所述小孔內。