[發明專利]一種基于碳點標記的熒光免疫吸附測定超痕量油胺枝接聚琥珀酰亞胺的方法

在審

• 申請號: 201711150938.1
• 申請日: 2017-11-18
• 公開（公告）號: CN107957492A
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 張明翠;李磊
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/533
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司34107
• 代理人: 尹婷婷

1.一種基于碳點標記的熒光免疫吸附測定超痕量油胺枝接聚琥珀酰亞胺的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a、制備PSI_OAm包被抗原和PSI_OAm免疫原；

b、制備抗PSI_OAm抗體；

c、制備氨基功能化熒光碳點C-dots；

d、制備碳點標記的抗PSI_OAm抗體；

e、將油胺枝接聚琥珀酰亞胺(PSI_OAm)包被抗原經包被液稀釋后包被于96孔板中，封閉、加入不同濃度的PSI_OAm標準品，以碳點標記的PSI_OAm抗體作為一抗，建立直接競爭熒光免疫分析定量檢測PSI_OAm；

f、以PSI_OAm標準液濃度的對數為橫坐標，吸光度值為縱坐標建立標準曲線，從而定量檢測出PSI_OAm的濃度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標準曲線的線性方程為F＝13955.82-981.93lgC，其中F為熒光強度值，C為PSI_OAm濃度；其相關系數R＝-0.997，線性范圍為5×10^-4～5×10²ng/mL，檢出限為0.15pg/mL。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c具體包括以下步驟：將無水檸檬酸和乙二胺溶解在超純水中，180℃水熱反應4-5小時，所得產物經純化后即可得到所述氨基功能化碳點C-dots。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述無水檸檬酸的質量與乙二胺的體積之比為0.42g：530μL。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d具體包括以下步驟：

d-1、向C-dots溶液中加入質量濃度為25％的戊二醛，兩者的體積之比為9～15：1，室溫攪拌1h，以超純水為透析液用100～500Da的透析袋進行透析；

d-2、向步驟d-1中加入與透析后的溶液等體積的抗PSI_OAm抗體溶液，攪拌反應1h，然后加入濃度20mg/mL的新制的硼氫化鈉溶液，于4℃冰箱中過夜；

d-3、將步驟d-2得到的溶液以去離子水為透析液，用25000～30000Da的透析袋透析純化，得到碳點標記的PSI_OAm抗體。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述C-dots溶液的濃度為162mg/mL，是將C-dots溶于10mM，pH＝9.6的碳酸鹽緩沖液中制備得到的。

7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述抗PSI_OAm抗體溶液的制備方法為：經抗PSI_OAm抗體，用pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至每毫升內含抗體2～3mg。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述硼氫化鈉溶液與C-dots溶液的體積之比為1:2～4。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟e具體包括以下步驟：

e-1、用包被緩沖液將PSI_OAm包被抗原稀釋60倍，包被96孔板中，每孔100μL，4℃冰箱過夜；

e-2、封閉：PBST溶液洗滌3次，甩干，每次3～5min，洗去未結合的PSI_OAm包被抗原,加入1wt％酪蛋白，每孔200μL進行封閉，37℃烘箱溫育1～2h；

e-3、加樣競爭：PBST溶液洗滌3次，甩干，每次3～5min，洗去多余的封閉液,然后將50μL碳點標記的PSI_OAm抗體和50μL不同濃度的PSI_OAm標準品分梯度加入各孔中，使之發生競爭反應，37℃烘箱溫育1～2h；

e-4、檢測：PBST溶液洗滌3次，甩干，每次3～5min，除去游離態的PSI_OAm標準品或抗體結合物,用多功能酶標儀測定各孔在激發波長為360nm，發射波長為475nm處的熒光強度值。

10.根據權利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述PSI_OAm包被抗原的濃度為1～3mg/mL。