[發(fā)明專利]一種檢測(cè)脊肌萎縮癥相關(guān)的基因突變的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711149047.4
• 申請(qǐng)日: 2017-11-17
• 公開（公告）號(hào): CN107881214A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋昉;白晉麗;瞿宇晉;曹延延;金煜煒;王紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都兒科研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠(chéng)輝律師事務(wù)所11430
• 代理人: 唐寧

1.一種脊肌萎縮癥患者SMN1基因突變的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：

(1)用抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制的藥物或抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制的干擾RNA處理來(lái)源于待測(cè)患者的細(xì)胞；

(2)提取處理后的目標(biāo)細(xì)胞中的總RNA；

(3)測(cè)定SMN1轉(zhuǎn)錄本并分析目標(biāo)突變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞為來(lái)自于脊肌萎縮癥患者的淋巴細(xì)胞系、皮膚成纖維細(xì)胞系或原代培養(yǎng)的細(xì)胞。

3.所述的無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制為UPF1基因調(diào)控的無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制；

所述的藥物為放線菌酮或嘌呤霉素；

所述的干擾RNA為shRNA，優(yōu)選的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述SMN1基因突變包括但不限于如下突變：p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等無(wú)義突變或移碼突變。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，

步驟(1)所述的用抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制的藥物處理目標(biāo)細(xì)胞的步驟為：向細(xì)胞懸液中加入放線菌酮，或向細(xì)胞懸液中加入嘌呤霉素，繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟(1)所述的用抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)的干擾RNA處理來(lái)源于待測(cè)患者的細(xì)胞為：用表達(dá)shRNA的RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，抑制NMD。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，加入放線菌酮的濃度為20～500μg/ml，優(yōu)選為50～150μg/ml；加入嘌呤霉素的濃度為20～500μg/ml，優(yōu)選為100～400μg/ml；培養(yǎng)時(shí)間為2～20小時(shí)，優(yōu)選為5～10小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的用表達(dá)shRNA的RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的步驟為：

1)制備UPF1基因RNAi慢病毒載體；

2)將其加入至患者皮膚成纖維細(xì)胞(終濃度為50MOI)，孵育24小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基并檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；

優(yōu)選的，所述的慢病毒載體為表達(dá)序列如SEQ ID NO.1所示的shRNA的慢病毒載體pGV248。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，

步驟(3)所述的測(cè)定SMN1轉(zhuǎn)錄本并分析目標(biāo)突變的方法包括但不限于：

1)用Real-time PCR方法對(duì)目標(biāo)突變進(jìn)行檢測(cè)；

或2)用一代sanger測(cè)序法對(duì)目標(biāo)突變進(jìn)行檢測(cè)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的用Real-time PCR方法測(cè)定SMN1轉(zhuǎn)錄本并分析目標(biāo)突變的步驟為：

1)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建：合成正常對(duì)照的樣品的cDNA第一鏈：用SMN1引物對(duì)擴(kuò)增SMN1，用GAPDH引物對(duì)擴(kuò)增GAPDH基因；擴(kuò)增后的產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體中，測(cè)序驗(yàn)證克隆子中插入的基因序列；

所述SMN1引物對(duì)序列為：

SEQ ID No.2、SEQ ID No.3；

2)提取上述2種質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)粒的堿基數(shù)推算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，并將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)稀釋成10³～10⁸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3)定量分析：利用SMN1特異性MGB探針和特異性引物對(duì)；以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增總體積為20μl，其中包含：

2×GoldStar TaqMan Mixture、

20ng的cDNA、

4pmol引物和4pmol的探針，

用7500Real-Time PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增循環(huán)條件為：95℃變性10分鐘,95℃15秒，60℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)。

所述的SMN1特異性MGB探針的序列為SEQ ID No.4；

所述的SMN1特異性引物對(duì)的序列為：SEQ ID No.5、SEQ ID No.6。

10.本發(fā)明還涉及一種使用權(quán)利要求1-9任一所述的方法制備的檢測(cè)脊肌萎縮癥患者SMN1基因突變的檢測(cè)試劑盒，其包含：

(1)抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制的藥物或shRNA；

(2)mRNA提取試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑；

(3)檢測(cè)目標(biāo)突變所需的引物、探針和必要的試劑。

所述的抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制的的藥物為放線菌酮或嘌呤霉素；

所述的抑制無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制的shRNA的序列如SEQ ID NO.1；

所述的SMN1基因突變包括但不限于如下突變：

p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等無(wú)義突變或移碼突變。