[發(fā)明專利]一種豬血凝血酶的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711148625.2
• 申請(qǐng)日: 2017-11-17
• 公開（公告）號(hào): CN107699555B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李起豎;吳健;蔣王輝;周建盛;周楠捷;藤聰慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江豐安生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/74
• 分類號(hào): C12N9/74
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 邢永

1.一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

Step1取新鮮豬血在4℃下離心分層，得到含凝血酶原的豬血血漿和含凝血酶的豬血血細(xì)胞；

Step2破碎豬血血細(xì)胞并溶于0.05mol/L 的Tris-HCl緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至7.0，攪拌1~2h后，離心取含凝血酶原的上清液A；

Step3將經(jīng)過0.05mol/L Tris-HCl緩沖液預(yù)處理的724離子交換樹脂裝柱，得到724離子交換樹脂柱，將上清液A過柱使上清液A中的凝血酶原吸附在724離子交換樹脂柱上，除去溶劑；

Step4用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液洗滌Step3中吸附有凝血酶原的724離子交換樹脂柱，洗滌至過724離子交換樹脂柱的Tris-NaCl緩沖液中無蛋白流出；

Step5配制0.2mol/LNaCl和0.05mol/L Tris-HCl緩沖液的混合溶液對(duì)Step4中的724離子交換樹脂柱進(jìn)行洗脫，收集主活性洗脫峰的凝血酶原溶液A；

Step6在豬血血漿中加入38g/L檸檬酸三鈉溶液至檸檬酸三鈉在豬血-檸檬酸三鈉混合液中的濃度為0.29g/L，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5之間，得豬血-檸檬酸三鈉混合液；

Step7用DEAE-sepharose A-50作為陰離子交換劑，通過0.2mol/L NaCl溶液浸泡處理20~40min后，瀝干表面NaCl溶液并凍干得到干粉狀的DEAE-sepharose A-50；

Step8按照1L豬血血漿加入1.7g干粉狀的DEAE-sepharose A-50的比例將Step7所得的DEAE-sepharose A-50加入豬血血漿中，攪拌吸附45min后，靜置30min，然后倒入砂芯漏斗濾去上清液，得到吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50；將未使用的DEAE-sepharoseA-50浸泡在0.2mol/L NaCl溶液中，放入4℃環(huán)境下保存20-30天；

Step9選擇0.2mol/L NaCl溶液作為洗滌液，洗滌液的每次用量為所量取的豬血血漿體積的1/40，對(duì)吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50洗滌兩次，將洗滌后吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50裝入洗脫柱；

Step10配制濃度為2mol/L NaCl-0.01mol/L檸檬酸三鈉混合溶液作為洗脫液，對(duì)吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50進(jìn)行洗脫，收集含凝血酶原的洗脫液；

Step11將SEPHADEX G-50經(jīng)過預(yù)處理后裝入脫鹽柱，將Step10所得含凝血酶原的洗脫液加入脫鹽柱脫鹽，除去溶劑，得到吸附有凝血酶原的脫鹽柱；

Step12向Step11所得吸附有凝血酶原的脫鹽柱中加入3g/L NaCl溶液洗脫，收集有活性洗脫峰的凝血酶原溶液B；

Step13將收集到的凝血酶原溶液A和凝血酶原溶液B混合后，加入CaCl₂溶液至CaCl₂溶液濃度稀釋至0.03~0.08mol/L，靜置至界面穩(wěn)定，得到含凝血酶的激活液；

Step14將Step13含凝血酶的激活液離心至激活液分層，濾去殘?jiān)螅瑢?duì)濾去殘?jiān)募せ钜哼M(jìn)行去病毒處理，得到凝血酶溶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，Step1中選用臥式離心機(jī)進(jìn)行離心，設(shè)定離心轉(zhuǎn)速為4020rpm，離心時(shí)間為15min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，Step1中完成離心后的離心液用層疊的雙層脫脂紗布進(jìn)行過濾。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，Step10中陰離子交換劑洗脫后用質(zhì)量為陰離子交換劑10倍的0.2mol/L NaCl溶液洗滌后，浸泡于0.2mol/LNaCl溶液中，在0℃下可保存20~30天。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，Step11中含凝血酶原的洗脫液的保持上樣量體積為脫鹽柱體積的10~15%。