[發明專利]一種從豬血中提取凝血酶的方法有效
| 申請號： | 201711147689.0 | 申請日： | 2017-11-17 |
| 公開（公告）號： | CN107674868B | 公開（公告）日： | 2020-06-05 |
| 發明（設計）人： | 柯祖敏;金潔;崔彬彬;徐玲玲;丁君芳;吳榮 | 申請（專利權）人： | 浙江豐安生物制藥有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/74 | 分類號： | C12N9/74 |
| 代理公司： | 北京維正專利代理有限公司 11508 | 代理人： | 邢永 |
| 地址： | 317399 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 豬血 提取 凝血酶 方法 | ||
1.一種從豬血中提取凝血酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：
（1）往豬血中加入檸檬酸三鈉溶液，加入豬血中的檸檬酸三鈉溶液的用量為每1L豬血加入7.0-8.0mL的檸檬酸三鈉溶液，將混合液離心至分層后收集上清液，上清液用雙層脫脂紗布過濾后得上清抗凝血漿；
（2）將步驟（1）所得的上清抗凝血漿用 A-50層析柱進行層析，上清抗凝血漿中的凝血酶原被吸附于A-50層析柱上，用濃度為0.1-0.3M/L的氯化鈉溶液Ⅰ洗滌A-50層析柱兩次，隨后用氯化鈉-氯化鈣混合溶液洗脫并激活吸附于A-50層析柱上的凝血酶原，得到凝血酶粗提液；
洗滌過程分兩次進行，每次洗滌時氯化鈉溶液Ⅰ的用量為每1L上清抗凝血漿加入24-26mL的氯化鈉溶液Ⅰ；
洗脫并激活凝血酶原的氯化鈉-氯化鈣混合溶液的氯化鈉的濃度為1.5-2.5M/L，氯化鈣的濃度為1.0-2.0M/L；
洗脫并激活凝血酶原的氯化鈉-氯化鈣混合溶液的用量為每100mL上清抗凝血漿加入18mL-20mL的氯化鈉-氯化鈣混合溶液；
洗脫并激活的操作分兩次進行，每次洗脫并激活的操作得到相應的流出液，兩次流出液的總和為凝血酶粗提液；
（3）將步驟（2）所得的凝血酶粗提液用樹脂層析柱進行層析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于樹脂層析柱上，用濃度為2.0-3.0g/L的氯化鈉溶液Ⅱ洗脫吸附于樹脂層析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；
（4）將步驟（3）所得的凝血酶精提液去除病毒后進行脫鹽濃縮，得凝血酶濃縮液；
（5）將步驟（4）所得的凝血酶濃縮液凍干，即得白色的粉狀凝血酶成品。
2.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取凝血酶的方法，其特征在于：
步驟（1）中加入豬血中的檸檬酸三鈉溶液的用量為每1L豬血加入7.5mL的檸檬酸三鈉溶液；
步驟（2）中洗滌A-50層析柱的氯化鈉溶液Ⅰ的濃度為0.2M/L；
步驟（2）中洗脫并激活凝血酶原的氯化鈉-氯化鈣混合溶液的氯化鈉的濃度為2.0M/L，
氯化鈣的濃度為1.5M/L；
步驟（3）中洗脫凝血酶的氯化鈉溶液Ⅱ的濃度為2.5g/L。
3.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步驟（2）中的洗滌的過程分兩次進行，每次洗滌時氯化鈉溶液Ⅰ的用量為每1L上清抗凝血漿加入25mL的氯化鈉溶液Ⅰ。
4.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步驟（2）中洗脫并激活凝血酶原的氯化鈉-氯化鈣混合溶液的用量為每100mL上清抗凝血漿加入19mL的氯化鈉-氯化鈣混合溶液。
5.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取凝血酶的方法，其特征在于：步驟（4）中的凝血酶精提液用孔徑為20nm的濾膜去除病毒。
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