[發(fā)明專利]一種豬血凝血酶的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711147686.7
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN107699554A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設計）人: 王福云;泮聞吉;張力超;李佳輝;吳秀燕
• 申請（專利權）人: 浙江豐安生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司11508
• 代理人: 邢永

1.一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

Step1.在豬血中加入檸檬酸三鈉溶液至檸檬酸三鈉在混合液中的濃度為0.2~0.3g/L，攪拌均勻，調節(jié)pH至6.5-7.5之間，得豬血-檸檬酸三鈉混合液；

Step2.將Step1所得豬血-檸檬酸三鈉混合液在4℃下離心分層，濾去殘渣，得到豬血血漿；

Step3.向Step2所得豬血血漿中加入干粉狀的陰離子交換劑，攪拌吸附40~90min后，濾去上清液，得到吸附有凝血酶原的陰離子交換劑，將其洗滌后裝入洗脫柱；

Step4.配制濃度為2~3mol/L NaCl-0.01~0.03mol/L檸檬酸三鈉混合溶液作為洗脫液，向Step3中裝有陰離子交換劑的洗脫柱中加入洗脫液，對吸附有凝血酶原的陰離子交換劑進行洗脫，收集含凝血酶原的洗脫液；

Step5.將SEPHAROSE G-50經(jīng)過預處理后裝入脫鹽柱，將Step4所得含凝血酶原的洗脫液加入脫鹽柱脫鹽，除去溶劑，得到吸附有凝血酶原的脫鹽柱；

Step6.向Step5所得吸附有凝血酶原的脫鹽柱中加入NaCl溶液洗脫，監(jiān)測從脫鹽柱中洗脫下來的洗脫液的電導率，并收集電導率在0.3~0.4x10⁴us/cm之間的脫鹽液，得到含凝血酶原的脫鹽液；

Step7.在Step6收集到的脫鹽液中加入CaCl₂溶液至CaCl₂溶液濃度稀釋至0.03~0.08mol/L，靜置至界面穩(wěn)定，得到含凝血酶的激活液；

Step8將Step7所得含凝血酶的激活液離心至激活液分層，濾去殘渣后，對濾去殘渣的激活液進行去病毒處理，得到凝血酶溶液。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

Step1.在豬血中加入38g/L檸檬酸三鈉溶液至檸檬酸三鈉在混合液中的濃度為0.29g/L，攪拌均勻，調節(jié)pH至6.5-7.5之間，得豬血-檸檬酸三鈉混合液；

Step2.將Step1所得豬血-檸檬酸三鈉混合溶液在 4℃下離心分層，濾去殘渣，得到豬血血漿；

Step3.優(yōu)選DEAE-sepharose A-50作為陰離子交換劑，通過0.2mol/L NaCl溶液浸泡處理20~40min后，瀝干表面NaCl溶液并凍干得到干粉狀的DEAE-sepharose A-50；

Step4.按照1L豬血血漿加入1.7g干粉狀的DEAE-sepharose A-50的比例將Step3所得的DEAE-sepharose A-50加入Step2所得的豬血血漿中，攪拌吸附45min后，靜置30min，然后倒入砂芯漏斗濾去上清液，得到吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50；

Step5.選擇0.2mol/L NaCl溶液作為洗滌液，洗滌液的每次用量為Step4所量取的豬血血漿體積的1/40，對吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50洗滌兩次，將洗滌后吸附有凝血酶原的DEAE-sepharose A-50裝入洗脫柱；

Step6.配制2mol/L NaCl-0.01mol/L檸檬酸三鈉混合溶液作為洗脫液，向Step3中裝有DEAE-sepharose A-50的洗脫柱進行兩次洗脫，收集兩次洗脫液；

Step7.將SEPHAROSE G-50經(jīng)過3g/L NaCl溶液浸泡處理20~40min后，裝入脫鹽柱，將Step6收集的洗脫液加入脫鹽柱脫鹽，除去溶劑，監(jiān)測從脫鹽柱中洗脫下來的洗脫液的電導率，并收集電導率在0.3~0.4x10⁴us/cm之間的脫鹽液，得到含凝血酶原的脫鹽液；

Step8.在Step7收集到的脫鹽液中加入1mol/L CaCl₂溶液至CaCl₂在總溶液中的濃度稀釋至0.05mol/L，40℃靜置20min，得到含凝血酶的激活液；

Step9將Step8所得含凝血酶的激活液離心分層后，濾去殘渣，對濾去殘渣的激活液去病毒處理，得到凝血酶溶液。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種豬血凝血酶的制備方法，其特征在于，Step2中選用臥式離心機進行離心，設定離心轉速為4020rpm，離心時間為15min。