[發明專利]九子連環草甘露糖結合蛋白

在審

• 申請號: 201711144535.6
• 申請日: 2017-11-17
• 公開（公告）號: CN107936100A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 鮑錦庫;吳傳芳;梁丹鳳;龍鑫;袁媛
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/10
• 代理公司: 成都中亞專利代理有限公司51126
• 代理人: 李文榮

技術領域

本發明涉及分子生物學基因工程技術領域，具體涉及一種編碼九子連環草甘露糖結合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。

背景技術

九子連環草，Calanthe discolor Lindl.，屬于蘭科植物，是一種傳統的中草藥，性溫，味甘辛，無毒。可用以散結，解毒，活血，舒筋。九子連環草作為一種常用中藥材，所含甘露糖結合蛋白豐度很低，但其凝血活性很強。單子葉甘露糖結合蛋白家族，是植物蛋白里的一個十分重要的家族分支，其組成成員十分龐大。這一家族的蛋白具有專一特異性結合甘露糖或甘露寡糖的能力，并且廣泛分布于單子葉植物中，同時還具有多種十分有價值的生物學活性，如抗真菌活性及抗蟲活性等。Van Damme,Balzarini J,Smeets等人先后從蘭科植物火燒蘭和二葉蘭的塊莖中分離出兩種以單體形式存在的抗真菌甘露糖結合蛋白(EHMBP和LOMBP)。目前，還沒有關于編碼蘭科植物九子連環草甘露糖結合蛋白的基因全序列報道。

發明內容

鑒于上述不足之處，本發明的目的在于提供一種編碼九子連環草甘露糖結合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。

本發明所述九子連環草甘露糖結合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本發明所述九子連環草甘露糖結合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

本發明通過從九子連環草新鮮嫩葉組織中提取的RNA，利用同源克隆和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術，快速克隆編碼九子連環草甘露糖結合蛋白的基因。

本發明具有以下有益效果：

使用本發明所述技術方法和引物能夠快速準確地獲得一種蘭科植物九子連環草甘露糖結合蛋白的基因全長序列及氨基酸序列。豐富了植物甘露糖結合蛋白家族成員信息，為后續應用和研究提供技術支持。

附圖說明

圖1是提取的九子連環草嫩葉組織的總RNA電泳圖譜，

圖2是對九子連環草甘露糖結合蛋白基因進行3’RACE克隆片段的電泳圖譜，其中A圖是第一輪擴增的PCR產物；B圖是第二輪擴增的PCR產物。

圖3是對九子連環草甘露糖結合蛋白基因進行5’RACE克隆片段的電泳圖譜。

圖4是九子連環草甘露糖結合蛋白的核苷酸序列(cDNA全長)的電泳圖譜。

具體實施方式

1.材料和方法

1.1材料

植物材料：九子連環草新鮮嫩葉組織：直接剪取。

菌株：所用克隆菌株為大腸桿菌(Escherichia coli(Migula)Castellani et Chalmers)Top 10。

質粒：pEASY-T1 Cloning Vector，大小為3928bp，具有氨芐青霉素(Amp)和卡那霉素(Kal)兩種篩選標記，便于重組子的篩選，具有帶游離T的5’-黏性末端，為PCR產物的專用克隆載體(購買于北京全式金生物技術有限公司)。

試劑盒和酶：Trizol試劑購買自Invitrogen公司；小量膠回收試劑盒購于Axygen公司。

T4 DNA Ligase、M-MLV反轉錄酶、TdT(核苷酸末端轉移酶)、Ribonuclease Inhibitor、EasyTaqDNA Polymerase、EasyPfuDNA Polymerase及Fermentas限制性內切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ均購自北京全式金生物技術有限公司。

其余化學藥品均為分析純試劑。

1.2方法

1.2.1九子連環草總RNA的提取

九子連環草總RNA的提取過程參照InvitrogenTrizol試劑盒的說明，如下：

(1)取0.1mg左右新鮮的或-80℃低溫保存的九子連環草嫩葉組織迅速置于充滿液氮的研缽中，將組織充分研磨成粉末狀；

(2)用藥匙將粉末分裝到兩個液氮預冷過的1.5mL離心管中，并向其中加入1mL的Trizol試劑，充分震蕩混勻，置于冰上約5min；

(3)向管中加入200μl氯仿，充分混勻后放置5min，然后在4℃，12，000g離心5min；

(4)將上層水相轉移到新的已預冷過的離心管中，加入500μl異戊醇，充分混勻后放置5min，然后在4℃，12，000g離心5min；

(5)倒掉上清，加入75％乙醇將沉淀懸起，4℃，7，500g離心3min；

(6)重復步驟5；