[發明專利]一種改良型腺病毒及其系統的構建方法和應用

有效

• 申請號: 201711137779.1
• 申請日: 2017-11-16
• 公開（公告）號: CN107937356B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 易俊波;張宇;鄒永東;劉立忠
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司 44217
• 代理人: 郭偉剛

1.一種改良型腺病毒系統的構建方法，其特征在于，所述改良型腺病毒用于制備免疫和基因治療的藥物，所述構建方法包括如下步驟：

S1、敲掉AD293細胞株的fiber基因；

S2、改造腺病毒Adeasy系統中穿梭載體，將fiber基因加入，使其能表達fiber蛋白；

S3、將目標蛋白裝入改良后的載體中，使其與fiber蛋白融合表達，其中目標蛋白N端與fiber蛋白C端首尾相連，表達質粒在Adeasy系統重組后得腺病毒穿梭質粒；

S4、將腺病毒穿梭質粒轉染改造后的AD293細胞，得到改良型腺病毒；

步驟S1具體包括：利用CRISPR/Cas9系統作為基因敲除工具，具體采用慢病毒操作PLVX-CRISPR-V2，針對AD293細胞基因組中fiber基因序列，設計gRNA敲除引物，其中上游引物：Knockout-fiber-F:5’-CACCGGAGCCCATTTATACACAAAATGG-3’，下游引物：Knockout-fiber-R:5’-AAACCCATTTTGTGTATAAATGGGCTCC-3’，構建PLVX-CRISPR-V2-fiber-out質粒，與共轉染質粒共轉染293T細胞，三天后得到慢病毒液，感染目標細胞株AD293，感染24小時后，加入1.5μg/ml嘌呤霉素篩選，二周后收集細胞團，轉移至細胞瓶中擴大培養，繼續以1.5μg/ml嘌呤霉素培養，待細胞瓶底長滿細胞后，以24孔板稀釋法篩選單克隆細胞，在每孔中加入50個細胞，一周后細胞成團，挑取細胞團轉移到6孔板中繼續培養，待細胞長滿孔底轉移至細胞瓶擴大培養，收集細胞，同時對細胞株進行鑒定，提取細胞RNA，反轉錄成cDNA，以fiber基因鑒定引物進行PCR擴增，其中上游引物：fiber-F:5’-TCTGGTACCATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAA-3’,下游引物：fiber-R:5’-TGGCAGCTGTAGCTTATCATTATTTTTGTT-3’，若沒有目的基因fiber擴增出，則為陽性的篩選成功的細胞株，凍存于液氮中，fiber基因敲除的AD293細胞株建立完成；

步驟S2具體包括：改造現有腺病毒系統AdEasy^TM中的穿梭載體，將fiber基因加入構建成pShuttle-CMV-fiber，以fiber基因通過提取AD293細胞RNA，反轉錄成cDNA，PCR擴增，其中上游引物：fiber-F:5’-TCTGGTACC ATGAAGCGCGCAAGA CCGTCTGAA-3’，下游引物：fiber-R:5’-TGGCAGCTGTAGCTTATCATTATTTTTGTT-3’，得到1200bp大小的fiber基因片段，同時以KpnⅠ和SalⅠ雙酶切pShuttle-CMV載體和fiber基因片段，連接轉化到細菌中，鑒定得到穿梭載體pShuttle-CMV-fiber；

步驟S3具體包括：將目標蛋白克隆入pShuttle-CMV-fiber中，使目標蛋白接入到fiber蛋白的后面構建成腺病毒表達質粒pShuttle-CMV-fiber-protein，將質粒pShuttle-CMV-fiber-protein單酶切線性化，膠回收后轉化到含有病毒骨架質粒AdEasy的BJ-5183-AD細菌中，挑取單克隆重組子培養，提取質粒進行酶切鑒定，得到陽性質粒pShuttle-CMV-fiber-protein-AD后，轉化入DH5α細菌中保存；

步驟S4具體包括：Pac Ⅰ酶酶切pShuttle-CMV-fiber-protein-AD質粒，回收30kbp大小的DNA片段，純化后轉染改造后的AD293細胞，3周后收細胞以反復凍融方式得到改良型腺病毒；

在步驟S4之后還包括：

S5、純化所述改良型腺病毒；

步驟S5具體包括：配制15％和40％的CsCl溶液，填充到Beckman的離心管中，將腺病毒溶液加入到梯度CsCl溶液中，30000rpm離心1小時，分層，取下層溶液，得到濃縮純化后的改良型腺病毒。