[發明專利]一種合成苯丙氨酰-賴氨酸二肽的方法

有效

• 申請號: 201711136557.8
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107936089B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 尹思力;朱云陽;張海龍;江文;楊洋;倪科;凌夢晨;周小華
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C07K5/065
• 分類號: C07K5/065;C12P21/02;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/14
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1.一種合成苯丙氨酰-賴氨酸二肽的方法，其特征在于具體的工藝步驟如下：

(1)制備苯丙氨酸和賴氨酸水溶液

在攪拌下先后將適量苯丙氨酸和賴氨酸溶解于純凈水溶液中，就制備出苯丙氨酸濃度為0.3～1.0mol/L，賴氨酸濃度0.3～2.0mol/L的水溶液；再用稀氫氧化鈉調節該水溶液的pH值為7.5～9.5，即制備出苯丙氨酸和賴氨酸水溶液，用于下步制備乙二醇非水反應介質；

(2)制備乙二醇非水反應介質

第(1)步完成后，將第(1)步制備的苯丙氨酸和賴氨酸水溶液與乙二醇溶液混合，其中苯丙氨酸和賴氨酸水溶液與乙二醇的體積之比為1L∶5～25L，攪拌處理1～3h，即制備出乙二醇非水反應介質，用于下步制備苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液；

(3)制備苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液

第(2)步完成后，于攪拌下在第(2)步制備的乙二醇非水反應介質中加入活力為1000～1500U/mg的胰凝乳蛋白酶，其中加入胰凝乳蛋白酶的質量與苯丙氨酸和賴氨酸的總質量之比為1kg∶20～50kg，然后控制溫度為35～45℃，反應15～20h，反應完成后，升溫到80～90℃，處理15～20min后抽濾，分別收集濾渣和濾液，對收集的濾液，即制備出苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液，用于下步制備凈化荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽的樹脂柱，對收集的濾渣，用純凈水反復洗滌，除去乙二醇后用于制備動物飼料添加劑；

(4)制備凈化荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽的樹脂柱

第(3)步完成后，先將第(3)步制備的苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液用純凈水稀釋3～6倍，再用恒流泵泵入裝有活化001×7陽離子交換樹脂或D0011離子交換樹脂的樹脂柱，其中該樹脂柱與第(3)步制備的苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液的體積之比為1L∶30～60L，泵入該苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液的流速為該樹脂柱體積(BV)的2～6倍，泵入該苯丙氨酰-賴氨酸二肽反應液完成后，分別收集荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的樹脂柱和卸載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的過柱液，對收集的荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的樹脂柱，泵入2～6BV的純凈水洗滌，洗滌完成后分別收集洗滌液和除去乙二醇的荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的樹脂柱，對收集的洗滌液，與收集的過柱液混合，用于制備回收乙二醇；對收集的除去乙二醇的荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的樹脂柱，即制備出凈化荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽的樹脂柱，用于下步制備苯丙氨酰-賴氨酸二肽洗脫液；

(5)制備苯丙氨酰-賴氨酸二肽洗脫液

第(4)步完成后，先向第(4)步制備的凈化荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽的樹脂柱中泵入0.1～0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，洗脫苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸，所述氫氧化鈉溶液的泵入流速為2～4BV/h，分別收集第1.5～2.5BV、第3.5～4.5BV、第5.0～6.5BV的洗脫液和卸載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的樹脂柱，對收集的該卸載樹脂柱，用于第(8)步制備再生樹脂柱；對收集的第1.5～2.5BV、第5.0～6.5BV的洗脫液，用于第(7)步制備回收苯丙氨酸和賴氨酸水溶液；對收集的第3.5～4.5BV的洗脫液，即制備出苯丙氨酰-賴氨酸二肽洗脫液，用于下步制備苯丙氨酰-賴氨酸二肽凍干粉；

(6)制備苯丙氨酰-賴氨酸二肽凍干粉

第(5)步完成后，將第(5)步制備的苯丙氨酰-賴氨酸二肽洗脫液泵入截留分子量為100～200Da的納濾器中，在表壓為0.1～0.5MPa的壓力下進行第一次納濾，直至納濾截留液與納濾濾過液的體積之比達到1L∶4～5L時停止納濾，分別收集第一次納濾濾過液和納濾截留液，對收集的第一次納濾截留液，再向其中加入純凈水至原體積，進行第二次納濾，第二次納濾的條件與第一次納濾條件相同，第二次納濾完成后，分別收集第二次納濾濾過液和截留液，對收集的第二次納濾濾過液，與第一次納濾濾過液進行合并，用稀鹽酸調節pH值為6.5～7.0后，泵入廢水處理池進行生化處理，達標后排放；對收集的第二次納濾截留液，置于低溫冰箱中在-40～-20℃的條件下預凍6～12h，再轉移至真空冷凍干燥機中，在溫度為-50～-40℃、真空度為20～50Pa的條件下進行冷凍干燥24～36h，即制備出苯丙氨酰-賴氨酸二肽凍干粉，其總收得率以苯丙氨酸計達到85～92％，該凍干粉中苯丙氨酰-賴氨酸二肽含量為95～98％；

(7)制備回收苯丙氨酸和賴氨酸水溶液

第(5)步完成后，將第(5)步收集的第1.5～2.5BV和第5.0～6.5BV的洗脫液進行合并，先泵入反滲透器中，在表壓為0.5～0.8MPa的條件下進行反滲透濃縮，直至無反滲透濾過液出現時止，分別收集反滲透濾過液和反滲透截留液，對收集的反滲透濾過液，用于洗滌再生樹脂柱；對收集的反滲透截留液，再裝入截留分子量為100Da的透析袋中，用純凈水進行透析6～10h，其中純凈水的體積為反滲透截留液體積的10～20倍，透析完成后，分別收集透析袋內液和透析袋外液，對收集的透析袋外液，用稀鹽酸調節pH值為6.5～7.0后送至生化處理池進行凈化，達標后排放；對收集的透析袋內液，即制備出回收苯丙氨酸和賴氨酸水溶液，調節其中的苯丙氨酸和賴氨酸濃度后可用于下批次第(1)步制備苯丙氨酸和賴氨酸水溶液；

(8)制備再生樹脂柱

第(5)步完成后，向第(5)步收集的卸載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸的樹脂柱中泵入純凈水進行洗滌，直至洗滌液pH值達到7.5～8.5時止，分別收集洗滌后的樹脂柱和洗滌液，對收集的洗滌后的樹脂柱，即制備出再生樹脂柱，可用于下批次進行荷載苯丙氨酰-賴氨酸二肽、苯丙氨酸以及賴氨酸處理；對收集的洗滌液，泵入生化處理池進行處理，達標后排放。