[發明專利]一種合成檜烯的基因工程菌及其構建方法與應用有效
| 申請號： | 201711130703.6 | 申請日： | 2017-11-15 |
| 公開（公告）號： | CN109777745B | 公開（公告）日： | 2020-04-24 |
| 發明（設計）人： | 咸漠;劉麗娟;張海波;黃世永 | 申請（專利權）人： | 中國科學院青島生物能源與過程研究所 |
| 主分類號： | C12N1/19 | 分類號： | C12N1/19;C12N15/81;C12P5/00;C12R1/865 |
| 代理公司： | 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211 | 代理人： | 鄧宇 |
| 地址： | 266101 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 合成 基因工程 及其 構建 方法 應用 | ||
1.一種合成檜烯的基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌的出發菌株為酵母菌，所述酵母菌敲除了GAL80基因，含有經過密碼子優化的檜烯合成酶基因SabS1，GenBank登錄號為DQ785794.1，其序列如SEQ1所示，所述檜烯合成酶基因SabS1整合在該酵母菌株染色體GAL80位點；所述酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK2-1C，基因型為MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2。
2.根據權利要求1所述的一種合成檜烯的基因工程菌，其特征在于，所述酵母菌還含有如下序列：
檜烯合成酶基因SabS1的啟動子-GAL1啟動子，記為PGAL1，其序列如SEQ2所示；
檜烯合成酶基因SabS1的終止子-CYC1終止子，記為TCYC1，其序列如SEQ3所示；
GAL80基因的起始密碼子上游的511bp，記為GAL80US，其序列如SEQ4所示；
GAL80基因的終止密碼子下游的501bp，記為GAL80DS，其序列如SEQ5所示。
3.權利要求2所述的一種合成檜烯的基因工程菌的構建方法，其特征在于，該構建方法包括如下步驟：
(1)將GAL80基因的起始密碼子上游的511bp，與終止密碼子下游501bp以及PGAL1-SabS1-TCYC1片段連接，構建供體DNA片段：GAL80US-PGAL1-SabS1-TCYC1-GAL80DS；
(2)將pML04質粒用限制性內切酶SwaⅠ和BclⅠ進行雙酶切，獲得線性化的pML104質粒；
(3)以序列TAAGGCTGCTGCTGAACGT為靶標序列，構建gRNA的表達片段；
(4)將步驟(1)-步驟(3)所述的供體DNA片段、線性化的pML104質粒和gRNA表達片段同時轉入釀酒酵母CEN.PK2-1C感受態細胞，得到酵母基因工程菌。
4.根據權利要求3所述的一種合成檜烯的基因工程菌的構建方法，其特征在于，該菌株構建方法包括如下步驟：
(1)先將經過密碼子優化的檜烯合成酶基因SabS1連接到商品質粒pESC-HIS，得到重組質粒pESC-HIS-SabS1，通過PCR獲得PGAL1-SabS1-TCYC1片段；然后將GAL80基因的起始密碼子上游511bp、PGAL1-SabS1-TCYC1片段、終止密碼子下游501bp依次連接到商品質粒pUC19，得到重組質粒pUC19-GAL80US-PGAL1-SabS1-TCYC1-GAL80DS，最后通過PCR獲得供體DNA片段：GAL80US-PGAL1-SabS1-TCYC1-GAL80DS；
(2)將pML04質粒先用限制性內切酶SwaI酶切7h，再加入限制性內切酶BclI酶切4h，將酶切產物通過凝膠回收，獲得線性化的pML104質粒；
(3)以靶標序列TAAGGCTGCTGCTGAACGT為中心，分別構建與質粒pML104同源的gRNA表達片段的上下游兩個片段，再通過重疊PCR將兩個片段融合到一起獲得完整的gRNA表達片段；
(4)將步驟(1)-步驟(3)所述的供體DNA片段、線性化的pML104質粒和gRNA表達片段同時轉入釀酒酵母CEN.PK2-1C感受態細胞，培養后獲得酵母基因工程菌，其中用量為：供體DNA片段400-1000ng、線性化的pML104質粒100-150ng、gRNA表達片段200-600ng。
5.權利要求1或2所述合成檜烯的基因工程菌在合成檜烯中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，將權利要求1或2所述的基因工程菌經一級種子培養基培養后，獲得的二級種子接種到二級種子培養基中進行發酵得到檜烯。
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