[發明專利]水稻普通核不育系的創制方法和應用

有效

• 申請號: 201711126948.1
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN107667853B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 李莉;宋書鋒;李懿星;王天抗;李新奇;袁定陽;鄺翡婷;袁隆平
• 申請（專利權）人: 湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 長沙楚為知識產權代理事務所(普通合伙) 43217
• 代理人: 歐陽羅

1.一種水稻普通核不育系的創制方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）通過基因編輯技術使水稻普通可育株系MsMs的育性基因CYP703A3表達水平降低或消失，獲得水稻普通核不育材料，自交后獲得含有該基因不育性狀且不含基因編輯載體的新的水稻普通核不育系msms；具體方法為：

選擇普通可育株系MsMs作為受體，利用基因編輯CRISPR-Cas9的方法，定點突變普通可育株系MsMs的雄性不育基因的靶標序列，培育、測序、篩選，得到普通核不育株系msms；

所述靶標序列如SEQ ID NO. 2所示；

2）構建工程核不育中間父本載體，所述工程核不育中間父本載體為包含可育基因和分選基因的水稻雙元表達載體；將該載體導入水稻普通核不育系msms，獲得轉基因苗；種植轉基因苗，收獲T0代種子，種植T0代種子，獲得T1代植株，PCR檢測，以獲得含有目的基因的擬可育中間父本材料，收獲T1代種子；3）種植T1代種子，PCR檢測，獲得不含篩選標記基因的可育中間父本材料msms^Ms-L；

4）以水稻普通核不育系msms為母本，以可育中間父本材料msms^Ms-L為父本，雜交，產生混合種子；

5）對混合種子進行熒光分選，分選出不含熒光的種子msms，用于與可育恢復系水稻MsMs進行雜交制種，產生的F1代雜交種子Msms，用于大田生產；分選出含熒光的種子msms^Ms-L用于繼續繁殖不含熒光的種子msms。

2.根據權利要求1所述的一種水稻普通核不育系的創制方法，其特征在于，步驟2）所述的中間父本載體中包含的分選基因為紅色熒光蛋白DsRed。

3.根據權利要求2所述的一種水稻普通核不育系的創制方法，其特征在于，所述步驟2）中構建工程核不育中間父本載體的過程如下：

以普通可育株系MsMs提取的基因組DNA作為模板，設計并合成特異性引物：

9311gDNAF(其序列如SEQ ID NO. 7所示)：GGGATGGGTGTTTGACTCTG；

9311g DNAR (其序列如SEQ ID NO. 8所示)：CCTGTGCTCACTCGGAAG；

擴增出如SEQ ID NO. 9所示的大小為4429 bp的基因組序列片段后，以該基因組序列片段構建“育性恢復基因-分選基因”的工程核不育中間父本載體。

4.根據權利要求3所述的一種水稻普通核不育系的創制方法，其特征在于，所述工程核不育中間父本載體構建過程為：通過In-Fusion轉化體系將擴增后如SEQ ID NO. 9所示的DNA片段插入到含有分選基因紅色熒光蛋白DsRed的載體中；獲得水稻雙元表達載體pCambia1300-DsRed-CYP703A3，其基因序列如SEQ ID NO.10所示。

5.根據權利要求4所述的水稻普通核不育系的創制方法，其特征在于，所述擬可育中間父本材料創制過程如下：將水稻雙元表達載體pCambia1300-DsRed- CYP703A3導入根癌農桿菌中得到互補根癌農桿菌EHA105轉化體，通過與水稻普通核不育系msms的細胞或組織接觸，從而使編碼不育基因的核苷酸轉入水稻細胞，并且整合到水稻細胞的染色體上，獲得轉基因苗；種植轉基因苗，收獲T0代種子，種植T0代種子，獲得T1代植株，PCR檢測，獲得擬可育中間父本材料。

6.權利要求1~5任一所述的方法用于水稻普通核不育系的育性恢復的應用。