[發明專利]人微小miR-106b-5p干擾片段的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201711126548.0
• 申請日: 2017-11-15
• 公開（公告）號: CN109777801A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 宋鑫;李真;孟旭東;宋登燕
• 申請（專利權）人: 信雅生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 上海宣宜專利代理事務所(普通合伙) 31288
• 代理人: 劉君

黑色素瘤死亡率高，研發抑制黑色素瘤細胞增殖的新分子治療靶點，可為黑色素瘤臨床治療提供的實驗室依據。MicroRNA(微小RNA，簡稱miRNA)是長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，在細胞增殖進程中起著重要作用，且有高組織特異性，不易降解，易于檢測等特性，是分子靶向治療理想靶標。因此，本發明提出一種人微小miR?106b?5p(hsa?miR?106b?5p)干擾片段構建方法及其在黑色素瘤細胞增殖中的應用，可為黑色素瘤基礎研究及臨床治療提供新的實驗證據。其中所述的miR?106b?5p全稱為：人微小核糖核酸?106b?5`端(hsa?miR?106b?5p)，曾用名hsa?miR?106b。

技術領域

本發明屬于生物技術及基因工程領域，具體涉及一種抑制黑色素瘤細胞增殖的人微小miR-106b-5p(hsa-miR-106b-5p)的干擾片段的構建方法及其應用。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，由約70～90個堿基大小的具發夾結構的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經Dicer酶加工后生成。其通過與靶mRNA分子3`非編碼區域(3’UTR)完全或不完全互補配對，降解mRNA或抑制其翻譯，在個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動中發揮重要作用。miRNA可在轉錄后水平調節多個蛋白表達，單個靶蛋白也可同時接受多個miRNAs共同調控，由此形成復雜而精細的調控網絡，發揮多種生物學作用。

惡性黑色素瘤死亡率高，放化療不敏感，晚期患者5年生存率低于5％。我國黑色素瘤發病率及死亡率逐年上升，且發病年齡呈年輕化趨勢。盡管分子靶向治療藥物的出現為黑色素瘤臨床治療帶來突破性進展，但令人遺憾的是，CTLA-4單抗、PD-1單抗、BRAF抑制劑和MEK抑制劑等多種靶向治療藥物均未在國內上市，且價格高昂，耐藥率高。因此，尋找黑色素瘤新的治療靶點尤為重要。

MicroRNA-106b-5p(miR-106b-5p)屬于高度保守的miR-106b-25簇，位于染色體7q22，515-bp區域的宿主癌基因微小染色體維持復合組件基因(MinichromosomeMaintenance complex Component7，MCM7)內含子13上。研究發現miR-106b-25簇在腫瘤進展中發揮癌基因作用。然而miR-106b-25簇各成員在腫瘤中的作用，至今尚未完全闡明。更重要的是，miR-106b-5p在黑色素瘤惡性進展中的作用尚不明確。

發明內容

本發明的目的是，提出人微小miR-106b-5p(hsa-miR-106b-5p)的干擾片段的構建方法及其在黑色素瘤細胞增殖方面的應用。其中所述的miR-106b-5p全稱為：人微小核糖核酸-106b-5`端(hsa-miR-106b-5p)。本發明的目的通過以下技術方案實現：

一、可特異性抑制hsa-miR-106b-5p表達的核苷酸片段的構建方法；

S1，設計與成熟hsa-miR-106b-5p互補的RNA單鏈序列(hsa-miR-106b-5p干擾序列)引物，化學合成該引物。

其中，利用miRbase(http://www.mirbase.org/)數據庫，獲得成熟hsa-miR-106b-5p的核苷酸序列(hsa-miR-106b-5p MIMAT0000680)。

S2，設計可特異性干擾hsa-miR-106b-5p的核苷酸序列，并合成其編碼基因序列。

S3，用PCR擴增及化學反應的方法，利用“模板序列”合成hsa-miR-106b-5p的干擾序列；

二、采用如上構建方法構建的hsa-miR-106b-5p干擾片段，其特征在于：可與成熟hsa-miR-106b-5p互補配對，形成雙鏈結構，進而抑制hsa-miR-106b-5p的功能。