[發(fā)明專(zhuān)利]低毒高產(chǎn)殺菌劑吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培養(yǎng)方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711125280.9
• 申請(qǐng)日: 2017-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109777760B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何亞文;金子靖
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12P17/10;C12R1/385
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 莊文莉

本發(fā)明提供一種低毒高產(chǎn)吩嗪?1?酰胺的基因工程菌株及培養(yǎng)方法和應(yīng)用。所述基因工程菌株為采用基因工程方法，將假單胞菌株P(guān)A1201基因組中的綠膿菌素PYO的編碼基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非編碼序列敲除，并將假單胞菌株P(guān)A1201中合成PCN相關(guān)基因的啟動(dòng)子替換為啟動(dòng)子PrhlI后獲得。本發(fā)明通過(guò)無(wú)痕敲除PA1201基因組中與毒性相關(guān)的2個(gè)基因，使其不再產(chǎn)生毒性物質(zhì)PYO，也增加了PCN前體物質(zhì)PCA的產(chǎn)量；通過(guò)啟動(dòng)子置換，顯著提高了PCN合成相關(guān)基因及基因簇的表達(dá)量；同時(shí)通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)工藝，進(jìn)一步提高了PCN的發(fā)酵效價(jià)，為新一代綠色微生物殺菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)與推廣提供了可能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程菌株技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種低毒高產(chǎn)吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

用綠色生物農(nóng)藥取代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)作物病害防治的的發(fā)展趨勢(shì)，有著環(huán)境友好，綠色低毒，針對(duì)性強(qiáng)等特點(diǎn)。上海交通大學(xué)從根際促生假單胞菌M18的代謝產(chǎn)物中提取到抗水稻紋枯病的代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸(PCA)，并以此為主要物質(zhì)制備了生物農(nóng)藥申嗪霉素，已于2011年申請(qǐng)到農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)藥登記證，并與2016年重新注冊(cè)，將批準(zhǔn)防治的病害擴(kuò)大到九種，分別為：水稻紋枯病、西瓜枯萎病、甜椒疫病、黃瓜灰霉病、黃瓜霜霉病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病、小麥全蝕病、小麥赤霉病。然而野生型促生拮抗菌M18的PCA產(chǎn)量很低，生產(chǎn)成本高，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模農(nóng)業(yè)工業(yè)生產(chǎn)。同時(shí)，PCA在中性及堿性條件下抑菌活性大幅度降低，適用環(huán)境限制大。

2015年，上海交通大學(xué)何亞文團(tuán)隊(duì)從重慶郊區(qū)采集水稻根際土壤，分離出了PCA產(chǎn)量高于M18菌株3-4倍并且可以同時(shí)產(chǎn)生有更高抑菌活性的物質(zhì)吩嗪-1-酰胺的假單胞菌株P(guān)A1201(菌種保藏號(hào)：CCTCC NO.M 2013441，參見(jiàn)Zhou L,Jiang H,Jin K,等.[Isolation,identification and characterization of rice rhizobacterium Pseudomonasaeruginosa PA1201producing high level of biopesticideShenqinmycinandphenazine-1-carboxamide][J].Wei sheng wu xue bao＝Acta microbiologica Sinica,2015,55(4):401.)。PCA的衍生物吩嗪-1-酰胺(PCN)是由基因phzH編碼酰胺基轉(zhuǎn)移酶催化PCA所得。與PCA相比，PCN在中性和堿性環(huán)境中有著穩(wěn)定的抑菌活性，且抑菌活性高于PCA五到十倍，有良好的應(yīng)用前景。黃豆粉培養(yǎng)基中野生型PA1201菌株P(guān)CN產(chǎn)量為0.489克/升，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)要求。而在現(xiàn)有專(zhuān)利及文獻(xiàn)中通過(guò)提高合成基因及基因簇表達(dá)量提高PCN產(chǎn)量，往往涉及重組質(zhì)粒，需要另行添加對(duì)應(yīng)抗生素，無(wú)法保證穩(wěn)定遺傳。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種低毒高產(chǎn)吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培養(yǎng)方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供一種制備可穩(wěn)定遺傳的基因工程菌株的方法，利用RNA-seq篩選鑒定PA1201內(nèi)源高效表達(dá)基因的啟動(dòng)子；去除PA1201基因組中PCN合成過(guò)程中前體物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物綠膿菌素(PYO)的編碼基因phzS及phzM，使PA1201更加安全和低毒同時(shí)可降低PCN合成前體的消耗；用篩選到的高效啟動(dòng)子置換PCN合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子，最終提高PCN的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)PCN的成本以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，研發(fā)出一種新型綠色微生物殺菌劑。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提供了一種低毒高產(chǎn)吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株，采用基因工程方法，將假單胞菌株P(guān)A1201基因組中的綠膿菌素PYO的編碼基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非編碼序列敲除，并將假單胞菌株P(guān)A1201中合成PCN相關(guān)基因的啟動(dòng)子替換為啟動(dòng)子PrhlI后獲得。

第二方面，本發(fā)明提供了一種低毒高產(chǎn)吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：