[發明專利]一種與煙草黑脛病0號、1號生理小種抗性基因Bs_t連鎖的SSR標記及其應用

有效

• 申請號: 201711124725.1
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN107619881B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 童治軍;肖炳光;曾建敏;陳學軍;方敦煌;吳興富;李永平
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 謝喬良;張玉

1.一種與煙草黑脛病0號、1號生理小種抗性基因Bs_t連鎖的SSR標記的應用，其特征在于，所述與煙草黑脛病0號、1號生理小種抗性基因Bs_t連鎖的SSR標記的編號為TM51207和TM55805，其擴增產物核苷酸序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.4所示；分子標記序列所對應的引物分別為：

TM51207序列的引物為TM51207F：5’- AAACGCTCCCAAATCTTCAA -3’，

TM51207R：5’- GGCAAAATCCTTACTAGTTCACG -3’；

TM55805序列的引物為TM55805F：5’- GAACTGGGAAGCTCACCAAA -3’，

TM55805R：5’- CCTCTCTTGCCCCTTTCTCT -3’；

應用方法為：以TM51207序列的引物和TM55805序列的引物分別擴增待檢測煙草基因組DNA，檢測PCR擴增產物：如果PCR擴增產物中分別含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列且不含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，即為含有抗煙草黑脛病0號、1號生理小種的純合基因型Bs_tBs_t；如果PCR擴增產物中分別含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列且不含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，即為含有其感病的純合等位基因型bs_tbs_t；如果PCR擴增產物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，同時含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列，即為含有煙草抗黑脛病0號、1號生理小種的雜合基因型Bs_tbs_t。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，以TM51207序列的引物進行PCR擴增的反應體系為50μL，其中包含5.0μL的1×buffer，1×buffer 為10mM Tris-Cl、pH=8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl₂，500μM的dNTPs，2.0μM的上下游引物，2.5U的rTaq聚合酶，30~100ng模板DNA，最后用ddH₂O補齊50μL。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，以TM51207序列的引物進行PCR擴增的反應條件為：95℃預變性5分鐘，按95℃變性30s、60℃復性30s、72℃延伸30s進行30個循環，72℃延伸5分鐘，4℃保存。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，以TM55805序列的引物進行PCR擴增的反應體系為50μL，其中包含5.0μL的1×buffer，1×buffer 為10mM Tris-Cl、pH=8.4、50mM KCl、1.5mM MgCl₂，500μM的dNTPs，2.0μM的上下游引物，2.5U的rTaq聚合酶，30-100ng模板DNA，最后用ddH₂O補齊50μL。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，以TM55805序列的引物進行PCR擴增的反應條件為：95℃預變性5分鐘，按95℃變性30s、60℃復性30s、72℃延伸30s進行30個循環，72℃延伸5分鐘，4℃保存。