[發(fā)明專利]一種通過芍藥子葉誘導(dǎo)愈傷組織再生不定芽的方法

在審

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• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN107873517A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫曉梅;潘慶;楊宏光;張麗杰;姚希諾;李雪婷;費日雯
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司21101
• 代理人: 張述學(xué)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種通過芍藥子葉誘導(dǎo)愈傷組織再生不定芽的方法。

背景技術(shù)

芍藥（Paeonia lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生宿根花卉，具有觀賞及藥用價值，是中國的傳統(tǒng)名花，栽培歷史悠久，素有“花相”之稱，是園林造景常用植物。

目前，芍藥的新品種培育工作多采用人工定向授粉、人工誘變和自然突變等傳統(tǒng)育種方法，但是芍藥的一些品種存在雄蕊瓣化或無雄蕊的問題，而且自然雜交授粉結(jié)實率低，種屬間的生殖隔離等因素限制了傳統(tǒng)育種方法的應(yīng)用。這些原因使芍藥傳統(tǒng)育種時間長、選擇效率低、更新速度慢，造成芍藥育種現(xiàn)狀難以滿足日益增長的花卉市場的需求。組織培養(yǎng)技術(shù)是目前常用的高效繁殖手段，而近年來轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，對于芍藥的品種改良更加有利。依賴芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)建立再生系統(tǒng)，實現(xiàn)芍藥基因的遺傳轉(zhuǎn)化，從而改變芍藥的生物學(xué)特性，為芍藥尋求一條高產(chǎn)、穩(wěn)定的繁殖道路是國內(nèi)外學(xué)者的共同研究目標。

在大多數(shù)植物中，葉片是公認的誘導(dǎo)愈傷組織最佳材料，而子葉是植物發(fā)育時的第一片葉，貯藏大量的養(yǎng)分，細胞分裂活躍。前人對芍藥的愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化均有不同程度的研究成果，但是大部分研究止于愈傷組織增殖，少部分研究雖有不定芽的分化，但都是以露地自然生長的外植體為材料，外植體存在污染難以控制的問題，前期的消毒處理浪費大量的人力物力，并且還受季節(jié)的影響，不能周年進行研究，制約了芍藥的快速育種和更新速度，此外愈傷組織分化周期長，容易褐化，不定芽分化率僅為10%-20%，并且芽長勢較弱。

發(fā)明內(nèi)容

為了彌補上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種通過芍藥子葉誘導(dǎo)愈傷組織再生不定芽的方法，可有效解決以芍藥外植體誘導(dǎo)愈傷組織污染率高的問題，提高不定芽分化率，增強芽的長勢，并且不受季節(jié)的影響，可以周年進行培育。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種通過芍藥子葉誘導(dǎo)愈傷組織再生不定芽的方法，其主要步驟是：

1) 芍藥種胚啟動培養(yǎng)：將種子消毒后進行切割，接種到以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加赤霉素0.5mg· L^-1，進行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間15d得到胚苗；

2) 芍藥組培苗壯苗培養(yǎng)：將胚苗轉(zhuǎn)接入以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加赤霉素0.5mg· L^-1，6-芐氨基嘌呤0.5 mg·L^-1，激動素0.5mg· L^-1，常規(guī)培養(yǎng)20-30 d得到生長健壯的組培苗；

3) 愈傷組織誘導(dǎo)：將組培苗的子葉從根部切下，接種到愈傷組織培養(yǎng)基，愈傷組織培養(yǎng)基以改良的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加噻苯隆0.5mg·L^-1，2,4-二氯苯氧乙酸0.2 mg·L^-1，聚乙烯吡咯烷酮1g·L^-1，培養(yǎng)時間45-60 d，得到飽滿鮮綠、結(jié)構(gòu)緊密的愈傷組織塊；

4) 不定芽分化培養(yǎng)：將愈傷組織塊接入不定芽分化培養(yǎng)基，不定芽培養(yǎng)基以改良的1/2MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加噻苯隆0.2 mg·L^-1，萘乙酸 0.5 mg·L^-1，聚乙烯吡咯烷酮1g·L^-1，培養(yǎng)時間45-60 d。

上述方案中，所述的改良1/2MS固體培養(yǎng)基的配方為：大量元素改良為NH₄NO₃ 412.5 mg·L^-1、KNO₃ 475 mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O 220 mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 185 mg·L^-1、KH₂PO₄ 350 mg·L^-1，其他微量元素、鐵鹽、有機成分含量不變。

上述方案中，所述的種子消毒的具體方法是：將芍藥種子置于流水下沖洗干凈，剝除種皮，在超凈工作臺用75％酒精浸泡30 s，無菌水沖洗一次，用滅菌濾紙吸干種子表面水分，再用0.1％HgCl₂ 浸泡5min，無菌水沖洗3～5遍，滅菌濾紙吸干種子表面水分，獲得消毒后的種子。

上述方案中，所述的芍藥種子的母本為粉玉奴、父本為粉玉樓。