[發明專利]一種高產桿菌肽A的地衣芽孢桿菌基因改組菌株及應用

有效

• 申請號: 201711121738.3
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN107904198B
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 陸兆新;徐超;呂鳳霞;別小妹;趙海珍;張充;朱筱玉
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/04;G01N33/68;C12R1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

本發明公開了一種高產桿菌肽A的地衣芽孢桿菌基因改組菌株及應用。本發明采取了育種新技術中的等離子體誘變技術，與傳統物理、化學誘變方法相結合，并采用基因組改組技術，效果明顯，產量提高顯著。本發明提供的用于桿菌肽A高效發酵生產的基因改組菌株F2?X1，降低了以地衣芽孢桿菌為發酵菌株，生產桿菌肽的成本。而且產量提高明顯，經所述條件發酵后，桿菌肽A產量可達到1.7g/L,適用于大規模發酵生產桿菌肽A。本發明提供的以HPLC檢測方法簡單準確，是用于快速準確檢測桿菌肽A產量。

技術領域

本發明涉及一種高產桿菌肽A的地衣芽孢桿菌基因改組菌株及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

桿菌肽是由是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌產生的一種對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有廣泛抑制作用的環肽。根據氨基酸組成和位置的不同，現已發現15種同系物，其中桿菌肽 A，分子式為C66H103N17O16S，是其中主要的活性物質，生物活性也最強。由于桿菌肽高效、無殘留及無毒副作用、并產生耐藥性及交叉耐藥性、排泄快等優點，廣泛應用于飼料農業等。

由于自然篩選到的野生菌活力低，營養條件苛刻，產能較低，通過誘變及基因改組后，能有效提高微生物產能。

目前，除了傳統的理化誘變技術外，近幾年發展起來一種新的生物誘變育種技術：常壓室溫等離子體（ARTP）技術，由裸露金屬電極結構的，大氣壓射頻輝光放電等離子體發生器產生的活性粒子，如電子、離子、光子、處于激發態的中性粒子及一些自由基能作用于細胞的核酸或蛋白質，從而引起細胞基因突變或結構及通透性改變。與傳統誘變技術相比，該技術操作簡便，條件溫和，適應范圍廣，而且誘變效果與其他誘變方法相結合能大大提高突變效果。ARTP技術雖然證明能有效引起基因突變，但是引起基因突變的機制還不清楚，產生的各種激發離子比例無法控制。

發明內容

技術問題

本發明為解決上述現有技術中所存在的技術缺陷，提供了一種高產桿菌肽A 的地衣芽孢桿菌基因改組菌株，目的在于，提高菌株發酵水平的同時降低發酵能耗和生產成本。

技術方案

為實現上述發明目的，采取的技術方案為：

一種高產桿菌肽A的地衣芽孢桿菌基因改組菌株，該菌株F2-X1保藏號為CGMCCNo. 14830。

所述高產桿菌肽A的地衣芽孢桿菌基因改組菌株的培養基為LB培養基。

所述高產桿菌肽A的地衣芽孢桿菌基因改組菌株可以在生產桿菌肽A方面得到應用。包括以下步驟：

（1） 斜面培養

地衣芽孢桿菌F2-X1在無菌條件下接種于固體斜面培養基上，37℃培養48h,其中所述的固體斜面培養基為LB培養基;

（2） 種子培養

將步驟（1）所培養的地衣芽孢桿菌在無菌條件下接種于液體種子培養基，37℃，180 rpm，培養12 h;其中所述的種子培養基為液體LB培養基;

（3） 發酵培養

將步驟(2)所述種子液在無菌條件下接種于培養基中，37℃，180 rpm，培養48 h;其中所述發酵培養基為LB液體培養基。

其中桿菌肽 A 含量檢測包括:將步驟(3)所得發酵液離心除菌體，加入兩倍體積無水乙醇，離心過膜后以HPLC檢測桿菌肽A產量。

桿菌肽A的 HPLC檢測方法為,以A：水+0.1%三氟乙酸；B：乙腈+0.1%三氟乙酸，為流動相進行梯度洗脫，其中，A相有30%線性增長為40%，時間為20 min,檢測波長為220 nm，柱溫35℃。

有益效果