[發(fā)明專(zhuān)利]一種新型Mettl21e基因敲除小鼠模型的創(chuàng)建

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711120886.3
• 申請(qǐng)日: 2017-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109777836A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金文;匡世煥;孫曉波;張彬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種新型Methyltransferase like 21E(Mettl21e)基因敲除小鼠模型的創(chuàng)建方法，屬于病理動(dòng)物模型的藥理用途領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)TALEN技術(shù)，使Mettl21e基因DNA序列發(fā)生移碼突變，從而蛋白質(zhì)發(fā)生相應(yīng)的移碼突變，導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼子，結(jié)果建立了Mettl21e基因敲除小鼠模型，由于Mettl21e與糖尿病、肥胖疾病密切相關(guān)，表明其可用于建立糖脂代謝紊亂疾病的小鼠模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型Methyltransferase like 21E(Mettl21e)基因敲除小鼠模型的創(chuàng)建，并涉及其在制作糖尿病、肥胖等病理模型的用途，屬于病理模型的藥理用途領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著人們生活條件的逐步改善，糖尿病在中國(guó)的發(fā)生率逐年增加，國(guó)內(nèi)的患病人數(shù)已經(jīng)成為世界首位。因此糖尿病已成為倍受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。骨骼肌在調(diào)控系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)上起著至關(guān)重要的的作用。一方面骨骼肌自身發(fā)生物質(zhì)代謝如糖代謝等調(diào)控系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)；另一方面骨骼肌能分泌肌因子作用于脂肪、肝臟等器官調(diào)節(jié)系統(tǒng)能量穩(wěn)態(tài)。

關(guān)于Mettl21e相關(guān)功能至今上尚未見(jiàn)報(bào)道，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Mettl21e在肌肉中高表達(dá)，與糖脂代謝有著密切的關(guān)系。也有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病和肥胖患者體內(nèi)改甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)，將Myostatin敲除后該基因表達(dá)顯著上調(diào)。因此，Mettl21e可能與骨骼肌的物質(zhì)代謝有密切的關(guān)系。

本發(fā)明利用技術(shù)創(chuàng)建了Mettl21e敲除小鼠動(dòng)物模型，本發(fā)明解決了篩選出對(duì)該靶點(diǎn)發(fā)揮作用藥物的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提供一種新的糖脂代謝紊亂的小鼠模型。

本發(fā)明的主要目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

目標(biāo)基因的TALEN/CRISPR靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)和體外構(gòu)建：針對(duì)每個(gè)基因，根據(jù)目標(biāo)基因的基因組序列，設(shè)計(jì)TALEN靶點(diǎn)位置。TALEN靶點(diǎn)位置盡量在基因CDS的前1/3，ATG之后，不在最后一個(gè)exon上，最好能破壞重要的domain和所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物isoform。每個(gè)基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建TALEN/CRISPR靶點(diǎn)各2-3個(gè)。

目標(biāo)基因TALEN/CRISPR細(xì)胞活性的驗(yàn)證：將構(gòu)建好的TALEN/CRISPR質(zhì)粒對(duì)，進(jìn)行SSA 活性檢測(cè)。選擇活性高的TALEN/CRISPR用于后續(xù)基因敲除小鼠構(gòu)建。

第一：TALEN/CRISPR mRNA顯微注射，構(gòu)建帶有基因突變的小鼠(時(shí)間周期：2-3個(gè)月。) 一共出生27只小鼠，兩周齡后，剪取4周齡出生小鼠任一只耳朵大約三分之一，提取基因組DNA。以此基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)測(cè)序圖可分析小鼠的突變情況：如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是WT(野生型)；如果測(cè)序峰在預(yù)定位置出現(xiàn)雙峰且2種峰恰好對(duì)應(yīng)不同的突變類(lèi)型則該小鼠為Mettl21e基因敲除首建鼠(Founder)。

第二：將帶有突變的首建者小鼠(founder)與野生型C57小鼠交配，出生的小鼠兩周齡后按上述方法進(jìn)行基因型鑒定。得到基因突變的雜合子小鼠(+/-)F1代，并進(jìn)行DNA測(cè)序，確認(rèn)目標(biāo)基因發(fā)生了移碼突變，從而目標(biāo)蛋白被缺失實(shí)現(xiàn)基因敲除。(時(shí)間周期：3-4個(gè)月。)

第三：基因型相同的雜合子小鼠(+/-)相互交配，得到基因敲除的純合子小鼠(-/-)F2 代。如果測(cè)序峰全是單峰說(shuō)明該小鼠是WT(野生型)；如果測(cè)序圖出現(xiàn)雙峰則該小鼠為雜合子；如果測(cè)序圖也是單峰但是在預(yù)期位置出現(xiàn)缺失突變則該小鼠為純合基因敲除小鼠，建立穩(wěn)定遺傳F1代小鼠品系，從而可以應(yīng)用于相關(guān)藥物的藥效評(píng)價(jià)。(時(shí)間周期：2-3個(gè)月)

附圖說(shuō)明

附圖1是TALEN/CRISPR基因敲除位點(diǎn)。

具體實(shí)施方式