[發明專利]硫酸軟骨素ABC酶蛋白的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201711120265.5
• 申請日: 2017-11-14
• 公開（公告）號: CN109777816B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 李曄;陳振婭;周朝;辛秀蘭;袁其朋
• 申請（專利權）人: 北京電子科技職業學院
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 鄭州德勤知識產權代理有限公司 41128
• 代理人: 王莉

本發明提供了一種ChSaseABC酶蛋白的制備方法，該方法包括：分別克隆所述硫酸軟骨素ABC酶基因和分子伴侶蛋白GroES基因，然后連接上述兩個蛋白基因到同一個表達載體，獲得含有所述硫酸軟骨素ABC酶蛋白和分子伴侶蛋白GroES的重組載體；將所述重組載體轉化到宿主細胞中進行表達，獲得含有所述硫酸軟骨素ABC酶蛋白和分子伴侶蛋白GroES的轉化體；以及培養所述轉化體，并進行物理破碎處理，制得所述硫酸軟骨素ABC酶蛋白。本發明還提供一種ChSase ABC酶蛋白及其應用。上述ChSase ABC酶蛋白具有高酶活，能夠用于生產低分子量硫酸軟骨素，并且硫酸軟骨素的生成條件不高、方法簡便且容易控制。

技術領域

本發明涉及基因工程和發酵工程領域中一種硫酸軟骨素ABC酶的制備方法及其應用。

背景技術

硫酸軟骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，簡稱為“ChSase”)是一類能將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。

隨著對ChSase的深入研究，發現硫酸軟骨素ABC酶(簡稱為“ChSase ABC”)有著廣泛的應用價值。科研人員利用ChSase ABC檢測硫酸軟骨素和生產低分子量硫酸軟骨素。鮑倫軍，楊建成等用ChSase ABC酶解-高效液相色譜的方法檢測魚翅中的透明質酸，采用ZORBAX糖分析柱，紫外檢測波長為226 nm，檢測到魚翅中透明質酸的質量分數為0.86-1.96%（鮑倫軍等. 魚翅中硫酸軟骨素的酶解-高效液相色譜法測定. 色譜，2002, 20(6): 557-559）。朱昱寧，敖雷等同樣用酶解高效液相色譜的方法檢測CS的含量，采用Ultimate XB-NH2柱，紫外檢測波長為232 nm，流動相為醋酸鈉緩沖液(pH5.6)-乙腈(950: 50)，流速為1.0 mL/min，此色譜條件可將CS A，B和C分開（朱昱寧等. 酶解高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量. 中國生化藥物雜志，2012, 33(6): 827-829）。

ChSase ABC在臨床應用方面也有很大的作用。例如，在緩解視網膜變性方面，可降解硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)，CSPGs是中樞神經系統(CNS)損傷后膠質瘢痕的重要組分，可抑制神經軸突再生；在提高后肢運動能力方面，ChSase ABC 可以修復脊柱損傷；近年來，Mark R Brown等經研究發現，突出椎間盤內的主要組分為蛋白聚糖，而用ChSase ABC 及ChSase AC則可特異性降解掉突出的椎管內的糖胺聚糖、降低椎管內壓，同時對椎管外周組織無損害（Brown，M D．Method for treating intervertebral disc displacement withenzymes [P]: US, 4696816, 1987-09-29）。

另外，對低分子量硫酸軟骨素的制備常采用酸水解法、離子交換法和酶解法。前兩種方法需要較復雜的實驗設備并且會污染環境，比較而言，酶解法需要的條件不高、方法簡便且容易控制。酶解法的關鍵在于獲得大量的硫酸軟骨素裂解酶。分離純化硫酸軟骨素裂解酶的方法非常復雜，通常需要經過多步的色譜純化，收率很低。異源重組表達ChSase ABC是常用來提高ChSase ABC產量的手段之一。然而對ChSase ABC的異源重組表達研究非常有限，現有技術中使用原核表達系統表達ChSase ABC酶蛋白后以活性蛋白狀態存在的比例很低，變性蛋白需經過變性、復性過程，制備過程繁瑣，成本較高。

發明內容

有鑒于此，為解決現有技術的不足，本發明采用分子伴侶協助硫酸軟骨素ABC酶正確折疊的方法，獲得了大量可溶性的ChSase ABC I蛋白，降低了包涵體的產量，大大減少了后續處理的復雜程序。

本發明的主要目的在于提供一種制備硫酸軟骨素ABC酶蛋白的方法，其中，所述方法包括：

1）重組載體：分別克隆所述硫酸軟骨素ABC酶基因和分子伴侶蛋白GroES基因，然后連接上述兩個蛋白基因到同一個表達載體，獲得含有所述硫酸軟骨素ABC酶蛋白和分子伴侶蛋白GroES的重組載體；