[發(fā)明專利]一種染色質(zhì)破碎方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711113635.2
• 申請日: 2017-11-13
• 公開（公告）號: CN107841533B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊海洋;李翔;錢政江
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種染色質(zhì)破碎方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）用甲醛交聯(lián)的方法固定細(xì)胞；

（2）將細(xì)胞離心后用緩沖液處理；

（3）將處理后溶液用微球菌核酸酶消化并超聲破碎；

步驟（2）所述緩沖液為緩沖液 A、緩沖液 CF1、緩沖液 CF2、緩沖液 N1和緩沖液 N2的組合；

所述緩沖液 A為Hepes、MgCl₂、DTT和 PMSF的組合；所述Hepes的pH為7.8-8；所述Hepes的終濃度為8-12mM；所述MgCl₂的終濃度為0.5-2mM；所述DTT的終濃度為0.5-2mM；所述PMSF的終濃度為0.2-1mM；

所述緩沖液CF1為KCl、NP40和緩沖液A的組合；所述KCl的終濃度為5-15mM；所述NP40的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-5%；

所述緩沖液CF2為KCl、NaCl、甘油、NP40和緩沖液A的組合；所述KCl的終濃度為5-15mM；所述NP40的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1-1%；所述NaCl的終濃度為50-100mM；所述甘油的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5-15%；

所述緩沖液N1為Tris、NaCl 、蔗糖、MgCl₂ 、KCl和CaCl₂的組合；所述緩沖液N1的pH為6.0-9.0；所述Tris的終濃度為13-20mM；所述NaCl的終濃度為10-20mM；所述蔗糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1-5%；所述MgCl₂的終濃度為3-10mM；所述KCl的終濃度為4-6mM；所述CaCl₂的終濃度為1-2 mM；

所述緩沖液N2包括NP40和緩沖液N1；所述NP40的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5-3%；

步驟（3）所述處理后溶液的DNA濃度為0.5-3 μg/μL；

步驟（3）所述微球菌核酸酶的添加量為微球菌核酸酶:DNA為1 U:10-30 μg；

步驟（3）所述消化的溫度為30-50℃；

步驟（3）所述消化的時(shí)間為10-30min；

步驟（3）所述超聲的步驟為間歇式啟動(dòng)5s，暫停30s；

所述超聲的頻率為20kHz；

所述超聲的循環(huán)數(shù)為3-5個(gè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，

所述緩沖液 A中，所述Hepes的pH為7.9；所述Hepes的終濃度為10 mM；所述MgCl₂的終濃度為1.5mM；所述DTT的終濃度為1mM；所述PMSF的終濃度為0.5mM；

所述緩沖液CF1中，所述KCl的終濃度為10 mM；所述NP40的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%；

所述緩沖液CF2中，所述KCl的終濃度為10 mM；所述NP40的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5%；所述NaCl的終濃度為75mM；所述甘油的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10%；

所述緩沖液N1中，所述緩沖液N1的pH為8.0；所述Tris的終濃度為15mM；所述NaCl的終濃度為15mM；所述蔗糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為3%；所述MgCl₂的終濃度為5mM；所述KCl的終濃度為5mM；所述CaCl₂的終濃度為1.5mM；

所述緩沖液N2中，所述NP40的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述處理后溶液的DNA濃度為1 μg/μL；

步驟（3）所述微球菌核酸酶的添加量為微球菌核酸酶:DNA為1 U:20μg；

步驟（3）所述消化的溫度為37℃；

步驟（3）所述消化的時(shí)間為15min。

4.一種用于染色質(zhì)破碎的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的緩沖液 A、緩沖液 CF1、緩沖液 CF2、緩沖液 N1、緩沖液 N2和微球菌核酸酶。

5.將權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法和/或權(quán)利要求4所述的試劑盒用于ChIP-Seq的文庫構(gòu)建和/或染色質(zhì)免疫共沉淀。