[發明專利]用于鑒定蘋果異脛小卷蛾的特異性引物及PCR檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201711111638.2
• 申請日: 2017-11-13
• 公開（公告）號: CN107868831B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 徐淼鋒;權永兵;黃永輝;遲遠麗;廖力;張衛東;林偉
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚志強

本發明提供了一種用于鑒定蘋果異脛小卷蛾的特異性引物，包括如上游引物ThL?Its319F和下游引物ThL?Its732R。還公開了具有用于鑒定蘋果異脛小卷蛾的試劑盒及其檢測方法，包括緩沖液、Taq DNA聚合酶、ddH₂O和上述的特異性引物對ThL?Its319F、ThL?Its732R。該特異性引物和試劑盒建立的常規PCR具有快速、靈敏和準確等優點，適用于蘋果異脛小卷蛾不同蟲態的檢測，為我國蘋果異脛小卷蛾在分子水平上的分類和近似種的快速鑒定奠定了基礎。研究結果可直接應用于進境水果中截獲的蘋果異脛小卷蛾的檢疫鑒定，對保護我國農林生產安全、維持生態平衡都有極為重要的意義。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域。

背景技術

蘋果異脛小卷蛾Thaumatotibia leucotreta(Meyrick,1913)異名蘋果異形小卷蛾Cryptophlebia leucotreta，隸屬鱗翅目Lepidoptera,卷蛾科Tortricidae,小食心蟲族Gapholitini,異脛小卷蛾屬Thaumatotibia，為我國進境植物檢疫性有害生物，該蟲為雜食性害蟲，主要寄主有鱷梨Persea americana、柑橘Citrus spp.、桃Prunus persica、番石榴Psidium guajava、芒果Mangifera sp.、玉米Zea mays、棉花Gossypium herbaceum、澳大利亞堅果Macadamia spp.、金合歡Acacia spp.、櫟木Quercus spp.、番櫻桃Eugenia spp.、甘蔗Saccharum officinarum、荔枝Litchi chinensis、茄子Solanum melongena、茶Camelliasinensis、辣椒Capsicum spp.等30科70多種植物，是具有重要經濟意義害蟲。

該蟲與堅果異脛小卷蛾Thaumatotibia batrachopa、蘋果蠹蛾Cydia pomonella、梨小食心蟲Grapholita molesta等卷蛾在形態和寄主植物上較為相似，僅憑成蟲的外部形態特征往往難于做出快速準確的鑒定。近年來，我國從南非進口的西柚、柑橘、葡萄等水果中多次截獲該蟲。在國外，該蟲也常有截獲報道，如Mazza(2014)報道意大利口岸首次截獲蘋果異脛小卷蛾，果實被危害率高達2％；Gilligan(2011)報告在美國加州首次發現該蟲；在丹麥、芬蘭、瑞典和英國等口岸偶爾有截獲該蟲的報道。

目前針對蘋果異脛小卷蛾的檢測鑒定主要依據成蟲外部形態特征和DNA條形碼序列進行鑒定。由于進口水果上截獲的通常為幼蟲，通過其外部形態特征往往難以鑒定，此時必須借助于分子生物學方法來鑒定。目前采用的分子鑒定方法主要通過測定其線粒體細胞色素氧化酶第一亞基基因(COI)片段序列，將測序結果導入數據庫中進行比對分析來鑒定，然而該方法所需的時間相對較長(需2～3天)。

發明內容

為了滿足進口水果的快速通關需求，本發明提供了一種用于鑒定蘋果異脛小卷蛾的特異性引物及PCR檢測方法和試劑盒，該特異性引物篩選自蘋果異脛小卷蛾及其近似種類的編碼核糖體RNA的基因(rDNA-ITS)。

編碼核糖體RNA的基因(rDNA)是真核生物中最為保守的結構基因，它以銜接重復的方式排列，每一個重復包括三個編碼區(分別編碼18S，5.8S和28S RNA基因)，編碼區之間被兩個ITS(Internal Transcribed Spacers)所分隔，重復之間分別被一個ETS(ExternalTranscribed Spacer)和一個IGS(Integenic Spacer)所分隔，由于rDNA在基因組內有數百個拷貝(增加了檢測的靈敏度)和ITS及IGS區域在種內的穩定性及種間的差異，使其成為許多生物遺傳變異研究的重要對象。

本發明所采取的技術方案是篩選了蘋果異脛小卷蛾及其近似種類的編碼核糖體RNA的基因(rDNA-ITS)的特異性引物，建立了該蟲的快速分子PCR檢測鑒定方法：