[發(fā)明專利]一種突變體核酸文庫(kù)構(gòu)建方法及得到的突變體核酸文庫(kù)

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711099850.1
• 申請(qǐng)日: 2017-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN109763172A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翟莉莉;章文蔚;王林;董宇亮;鄭越;劉芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大生命科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

一種突變體核酸文庫(kù)構(gòu)建方法及得到的突變體核酸文庫(kù)，所述方法包括：將切刻內(nèi)切酶的切刻位點(diǎn)序列插入環(huán)狀雙鏈核酸中，形成帶有切刻位點(diǎn)的環(huán)狀雙鏈核酸；使用第一切刻內(nèi)切酶和核酸外切酶切刻、消化帶有切刻位點(diǎn)的環(huán)狀雙鏈核酸的第一條鏈；在聚合酶的作用下，以第二條鏈為模板，在含有突變位點(diǎn)的引物的存在下進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，然后在連接酶的作用下將合成的突變體鏈兩端連接；使用第二切刻內(nèi)切酶和核酸外切酶切刻、消化上一步產(chǎn)物中的第二條鏈，得到單鏈環(huán)狀突變體鏈；和以單鏈環(huán)狀突變體鏈為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，得到突變體核酸文庫(kù)。本發(fā)明的方法具有無(wú)偏性、高通量、高效性和簡(jiǎn)單易行的優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變體核酸文庫(kù)構(gòu)建方法及得到的突變體核酸文庫(kù)。

背景技術(shù)

定點(diǎn)突變技術(shù)是有目的性的在已知DNA序列中取代、插入或刪除一定的核苷酸片段，可以有目或針對(duì)性地改變DNA序列中的堿基次序，可以用來(lái)表明基因的調(diào)控機(jī)理，也可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，是基因研究中的一種常用手段。定點(diǎn)突變技術(shù)通過(guò)寡核苷盒式誘變、寡核苷酸引物介導(dǎo)、重疊延伸介導(dǎo)和PCR介導(dǎo)等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。盒式突變是利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，替代原基因中相應(yīng)序列，該方法簡(jiǎn)單易行，但是成本高。引物介導(dǎo)是利用含有突變堿基的引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)對(duì)DNA分子的復(fù)制，該方法雖然被廣泛應(yīng)用，但是存在突變效率低的問(wèn)題。重疊延伸和PCR介導(dǎo)的突變法為定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行基因修飾、改造提供了另一條更方便的途徑，但是該方法后續(xù)工作比較復(fù)雜，而且易發(fā)生其它突變。總之，現(xiàn)有技術(shù)中的定點(diǎn)突變存在突變率低、操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、成本高的缺陷需要解決。

切刻內(nèi)切酶是一種限制性核酸內(nèi)切酶，它能特異性識(shí)別雙鏈DNA中的一段核苷酸序列，只水解雙鏈DNA的中的一條鏈，對(duì)DNA鏈進(jìn)行切刻而不是切割，其活性表現(xiàn)為將超螺旋核酸(例如質(zhì)粒)改變?yōu)榍锌诤怂?例如切口質(zhì)粒)的能力。切刻內(nèi)切酶有很多種，一般常用的是Nb.Btsl、Nt.Btsl、Nb.BbVCI、Nt.BbVCI等，通常它們是切刻DNA的一對(duì)酶，例如Nb.BbVCI、Nt.BbVCI分別切刻雙鏈DNA中的兩條鏈。基于切刻內(nèi)切酶有很多應(yīng)用，例如，基于切刻內(nèi)切酶的網(wǎng)狀滾環(huán)擴(kuò)增體系及應(yīng)用；基于切刻內(nèi)切酶的核酸信號(hào)放大技術(shù)用于蛋白及DNA修飾酶的熒光檢測(cè)。

DNA滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)是一種利用特定DNA聚合酶，例如phi29DNA聚合酶，在恒溫條件下，根據(jù)已有的環(huán)狀DNA模板產(chǎn)生單鏈DNA分子的DNA擴(kuò)增技術(shù)。反應(yīng)在常溫進(jìn)行不需要熱循環(huán)加熱器，例如，PCR儀。它還有一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)以DNA閉合環(huán)為模板擴(kuò)增時(shí)，RCA的產(chǎn)物可以直接用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌或酵母菌，在轉(zhuǎn)化子內(nèi)重新環(huán)化目的DNA片段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種突變體核酸文庫(kù)構(gòu)建方法及得到的突變體核酸文庫(kù)，具有無(wú)偏性、高通量、高效性和簡(jiǎn)單易行的優(yōu)勢(shì)。

根據(jù)第一方面，一種實(shí)施例中提供一種突變體核酸文庫(kù)構(gòu)建方法，該方法包括：

(1)將切刻內(nèi)切酶的切刻位點(diǎn)序列插入環(huán)狀雙鏈核酸中，形成帶有切刻位點(diǎn)的環(huán)狀雙鏈核酸；

(2)使用第一切刻內(nèi)切酶和核酸外切酶切刻、消化上述帶有切刻位點(diǎn)的環(huán)狀雙鏈核酸的第一條鏈；

(3)在聚合酶的作用下，以第二條鏈為模板，在含有突變位點(diǎn)的引物的存在下進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，然后在連接酶的作用下將合成的突變體鏈兩端連接；

(4)使用第二切刻內(nèi)切酶和核酸外切酶切刻、消化步驟(3)產(chǎn)物中的第二條鏈，得到單鏈環(huán)狀突變體鏈；和

(5)以上述單鏈環(huán)狀突變體鏈為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，得到突變體核酸文庫(kù)。

進(jìn)一步地，上述環(huán)狀雙鏈核酸是帶有表達(dá)元件的質(zhì)粒，優(yōu)選質(zhì)粒PET28a-kod。

進(jìn)一步地，上述切刻內(nèi)切酶的切刻位點(diǎn)序列插入上述質(zhì)粒的表達(dá)框之外，優(yōu)選終止密碼子之后。