[發明專利]一種鼠李糖乳桿菌免疫磁珠電化學傳感器檢測方法

有效

• 申請號: 201711097367.X
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107746876B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 楊振泉;薛宇;蔣棟磊;高璐;饒勝其
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;G01N27/48
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種牛乳中鼠李糖乳桿菌的免疫磁珠電化學傳感器檢測方法，其特征在于：用鼠李糖乳桿菌特異性免疫磁珠結合電化學傳感器對牛乳中鼠李糖乳桿菌進行定量檢測；所述的鼠李糖乳桿菌特異性免疫磁珠是帶有鼠李糖乳桿菌特異性菌毛亞基SpaA抗體的磁珠；具體步驟是：

1)鼠李糖乳桿菌特異性菌毛亞基SpaA的表達、純化及多克隆抗體制備；

2)鼠李糖乳桿菌特異性免疫磁珠的制備：取2mg羧基修飾磁珠PM3-020于1.5mL離心管中，用500μL MEST洗滌2次磁分離棄去上清；加入新配制的200μL 5mg/mL EDC和200μL 5mg/mL NHS混勻，37℃活化30min磁分離棄去上清；加入500μL MEST混勻，將磁珠轉移至新的離心管中，用500μL MEST洗滌2次得到活化磁珠；向活化磁珠中加入SpaA多抗，用PBST0.01mol/L、pH 7.4溶液調節總體積至500μL輕輕混勻，37℃偶聯3h磁分離棄去上清，加入1mL PBST、pH 7.4、含1％BSA重懸磁珠，37℃封閉45min，用500μL PBST洗滌3次加入200μLPBST、pH 7.4含0.02％NaN₃、0.5％BSA重懸4℃保存備用；

3)免疫磁珠富集結合電化學傳感器對牛乳中鼠李糖乳桿菌進行定量檢測，操作步驟為：將磁性玻碳電極Φ＝5mm依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al₂O₃拋光粉打磨，然后用無水乙醇、超純水依次超聲清洗5min，氮氣吹干，4℃保存備用；取500μL梯度稀釋的鼠李糖乳桿菌懸液樣品與10μL免疫磁珠混合，37℃孵育60min，磁分離2min后棄上清，磁珠用500μLPBST洗滌3次；加入10μL HRP標記SpaA多抗，PBST補充至200μL，37℃孵育60min，磁分離2min后棄上清；用500μL PBST洗滌3次后，滴加至打磨好的磁性玻碳電極上，在CHI660E電化學工作站進行電化學檢測；檢測采用三電極體系：磁性玻碳電極Φ＝5mm作為工作電極，鉑絲與飽和甘汞電極分別用作對電極和參比電極；反應體系為含有1mmol/L H₂O₂和1mmol/L對苯二酚的PBS緩沖溶液；掃描范圍為-0.25V至0.25V，脈沖振幅為50mV，脈沖寬度為50ms，掃描速率為60mV/s；分析測定樣品電流的響應值和樣品中鼠李糖乳桿菌濃度的對應關系，繪制標準曲線，確定線性范圍，所有測量均在室溫下進行。