[發明專利]小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT-PCR快速檢測方法

在審

• 申請號: 201711096439.9
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN108060264A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 羅寶正;李儒曙;蘇惠龍;邵建宏;趙福振;薄清如;鄧湘輝;黃錚
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚志強

本發明提供了一種小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT?PCR快速檢測方法，包括小反芻獸疫病毒引物對和探針，藍舌病病毒引物對和探針，其中兩組探針的5’端和3’端分別用不同的熒光報告基團及配套的熒光淬滅基團標記。該快速檢測方法能夠對單個樣本一次性檢測兩種病毒，具有敏感、高效的優點，臨床應用價值優異。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種基于病毒核酸序列的基因檢測試劑盒，及其檢測方法。

背景技術

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)又稱羊瘟，是由小反芻獸疫病毒(PPRV)引起小反芻獸的急性接觸性傳染病，以發熱，口腔、舌黏膜糜爛，流淚，流鼻液，腹瀉和肺炎為特征；藍舌病(Bluetongue，BT)是由藍舌病病毒(BTV)引起反芻動物的非接觸性傳染病，以高熱，口腔、鼻腔和胃腸道黏膜水腫，潰瘍性炎癥變化為特征。小反芻獸疫病毒(PPRV)主要感染山羊、綿羊、小鹿瞪羚、努比亞野山羊、長角羚及其它小反芻獸。駱駝、豬和牛也可感染，但通常無臨床癥狀。藍舌病病毒(BTV)對綿羊、山羊和牛易感，一般情況下，綿羊感染后的臨床癥狀明顯，山羊和牛呈隱性感染。小反芻獸疫和藍舌病(以下簡稱“兩病”)在我國均列為一類動物疫病，在我國周邊國家及國內多個省份都有發生，特別是羊的小反芻獸疫近年疫情形勢嚴峻。羊在感染“兩病”后的臨床癥狀不易鑒別，且近年發現“兩病”常有雙重混合感染的情形存在，在國外被稱為小反芻獸的跨界疾病。但是現行缺乏快速檢測小反芻獸疫病毒和藍舌病病毒的方法，給后續開展的防控、檢疫工作帶來很大的困難。

對“兩病”的診斷，一般是采用Elisa抗體篩查、單重RT-PCR或普通RT-PCR檢測的方式。由于動物交易活躍，動物免疫背景不清，導致Elisa抗體篩查結果并不準確；單重RT-PCR費時費力，無法滿足高通量檢測的需求；而普通PCR的檢測敏感性較差。

發明內容

本發明旨在提供一種利用雙重熒光RT-PCR快速同時鑒別小反芻獸疫病毒和藍舌病病毒的檢測方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT-PCR快速檢測方法，包括RT-PCR反應液、酶混合液、小反芻獸疫病毒/藍舌病病毒雙重反應液和去RNA酶水。其中小反芻獸疫病毒/藍舌病病毒雙重反應液包括：(1)一對小反芻獸疫病毒引物和一條小反芻獸疫病毒探針組成；(2)一對藍舌病病毒引物和一條藍舌病病毒探針組成。

具體引物和探針如表1所示。

表1雙重熒光RT-PCR引物和探針

進一步，小反芻獸疫病毒探針用ROX熒光報告基團和BHQ2熒光淬滅基團標記，藍舌病病毒探針用FAM熒光報告基團和BHQ1熒光淬滅基團標記。

進一步，所述RT-PCR的擴增程序為：42℃15min；95℃3min；95℃15s，55℃45s，共40個循環。

本發明提供的小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT-PCR快速檢測方法，對單個樣本一次性檢測兩種病毒，具有敏感、高效的優點，臨床應用價值優異。

附圖說明

圖1是小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT-PCR快速檢測方法特異性檢測曲線圖；

圖2是小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT-PCR快速檢測方法靈敏度檢測曲線圖；

圖3是小反芻獸疫病毒與藍舌病病毒雙重熒光RT-PCR快速檢測方法樣品檢測曲線圖。