[發(fā)明專利]一種快速檢測氯霉素殘留的方法

在審

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• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107884569A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳軍;鄭利;張嶸
• 申請（專利權(quán)）人: 陳軍;鄭利;張嶸
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544;G01N21/45
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙)32251
• 代理人: 王華

1.一種快速檢測氯霉素殘留的方法，其特征在于：包括下列步驟：

第一步：制備氯霉素半琥珀酸酯

將氯霉素、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合，攪拌使可溶物溶解，回流反應(yīng)后得到的反應(yīng)液經(jīng)濃縮，得淡黃色粘稠液體，用乙酸乙酯洗出，然后加1M的HCl分層，取有機(jī)相，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的 NaHCO₃轉(zhuǎn)溶后，用濃鹽酸將pH值調(diào)至2，用乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相，經(jīng)濃縮后即得氯霉素半琥珀酸酯；

第二步：制備包被原

將氯霉素半琥珀酸酯溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃條件下預(yù)冷10min后加入三丁胺混勻，接著加入氯甲酸異丁酯，3~5℃條件下攪拌18~22min，然后加入到牛血清蛋白溶液中，3~5℃條件下攪拌反應(yīng)3~5h，反應(yīng)產(chǎn)物用0.05 M 的pH值為7.4的PBS緩沖液透析，獲得氯霉素-BSA偶聯(lián)物受體；所述牛血清蛋白溶液的制備方法為：將牛血清蛋白溶于二甲基甲酰胺中，2~5℃條件下預(yù)冷，再將pH值調(diào)至8，即得牛血清蛋白溶液；以氯霉素計(jì)算，氯霉素與牛血清蛋白的摩爾比為45~55：1；

第三步：制備免疫原

將卵清蛋白和氯霉素溶在5 mL冰冷的0.05M的硼砂緩沖液中，4℃攪拌，將上述1.5 mL A溶液逐滴加入到該溶液中，避光反應(yīng)1 h，得到氯霉素包被抗原溶液，用pH值為7.4的PBS緩沖液透析5d，每12 h更換一次透析液，將透析后的溶液離心300015 min，棄沉淀，凍干上清液，獲得免疫原；

第四步：光纖傳感器抗原包被修飾

將APS光纖傳感器末端沒入包被原溶液中，室溫靜置5 min；再將APS光纖生物傳感器末端沒入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的蔗糖水溶液中，室溫靜置1 min，然后室溫晾干后置于2～8℃干燥條件下保存，備用；

第五步：金標(biāo)氯霉素包被原制備

向1 ml膠體金中加入1μL的0.5mg/ml的氯霉素-BSA偶聯(lián)物受體，渦旋混勻，室溫靜置15 min，加入100 μL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的牛血清白蛋白溶液，室溫封閉15 min，10000 rpm離心10 min，棄掉上層清液，加入90 μL pH值為 7.4 的PB緩沖液，重懸顆粒，得到金標(biāo)BSA；

第五步：檢測

將氯霉素-BSA偶聯(lián)物用pH值為7.4的PB緩沖液稀釋20倍，取200μL于微孔板的第2列；用巴氏殺菌奶稀釋氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品到0.1、0.05、0.025和0.0125 ng/ml，分別取200 μL于微孔板的第4列，并加入5μL金標(biāo)氯霉素抗體、50μL反應(yīng)液，混勻；往微孔板第1列中加入200 μL水，往微孔板的第3列加入200μL巴氏殺菌奶、5μL金標(biāo)BSA、50μL反應(yīng)液，混勻；用APS光纖傳感器進(jìn)行檢測：第一列60 s，第2列60 s；第3列60 s；第4列400 s。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測氯霉素殘留的方法，其特征在于：還包括APS光纖傳感器的再生，包括：

平衡：將APS光纖傳感器末端沒入空白基質(zhì)底液中120s，該空白基質(zhì)底液含有200μL的底液、50 μL的反應(yīng)液、5μL金標(biāo)BSA；

檢測：將APS光纖傳感器末端沒入氯霉素素檢測陰性底液600s，該氯霉素素檢測陰性底液含有200μL氯霉素素檢測陰性樣液、50μL反應(yīng)液和5μL金標(biāo)氯霉素素受體；

再生：將APS光纖生物傳感器探頭底部沒入Gly/DMF30 s，該Gly/DMF由4倍體積的0.1 M甘氨酸溶液與1倍體積的二甲基甲酰胺混合混合后構(gòu)成；

洗滌：用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌APS光纖生物傳感器探頭底部一次。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測氯霉素殘留的方法，其特征在于：所述反應(yīng)液為pH 值為7.4的PBS緩沖液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測氯霉素殘留的方法，其特征在于：所述底液為奶粉溶于水后制得，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。