[發明專利]一種用于RCA擴增產物的快速銀染色方法

有效

• 申請號: 201711095852.3
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107828863B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 趙國杰;陳紫薇;關一夫;魏華
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 陳錚

本發明屬于生物化學、分子生物學、核酸擴增的檢測方法領域，是一種用于RCA肉眼檢測的管底固定凝膠的快速銀染色方法。該方法中，將含有待檢測RCA擴增產物的凝膠固定在管底，通過直接在管中加入和移出銀染色所需的試劑，對管底的凝膠進行銀染色。進而實現對凝膠中RCA樣品的半定量或定性分析。該方法為基于RCA的檢測技術提供了快速、簡便、可視化的檢測技術，具有實用價值和廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物化學、分子生物學、核酸擴增的檢測方法領域，具體涉及一種用于RCA肉眼檢測的管底固定凝膠的快速銀染色方法。

背景技術

核酸檢測技術是一種應用十分廣泛的分子檢測手段。用于物種鑒定，親子鑒定，科學研究等眾多領域。核酸擴增技術即是一種十分常用的核酸檢測技術，通過對特定核酸序列的擴增實現目的核酸的富集和信號的放大。

與PCR的變溫核酸擴增技術不同，滾環擴增（rolling circle amplification,RCA）是一種核酸恒溫擴增技術，因此其擴增不需要變溫設備，更加方便快捷。RCA以單鏈DNA為模板，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，延伸引物3’末端，形成與模板DNA序列互補的長鏈DNA單鏈產物。該擴增原理簡單，操作方便，檢測靈敏度高。

RCA擴增產物的檢測一般采用熒光檢測，需要電泳儀或酶標儀等檢測設備。不依賴儀器設備的肉眼檢測方法可以使人們更方便快捷的獲知結果，尤其在不具有儀器設備的地區有更多的需求。現有的肉眼檢測往往需要偶聯核酶顯色或納米金顆粒等進行顯色，這增加了RCA模板設計和技術的復雜性和原料成本。一種普適性強的，設計和操作均更為簡便的RCA肉眼檢測方法將會給RCA檢測帶來很大的便利。

電泳技術雖然作為RCA的常用檢測方法之一，但需要配膠，上樣，電泳，染色，操作繁瑣，耗時費力。而且RCA產物由于分子量巨大，一般位于上樣孔附近，電泳的分離效果有限，因此，開發不依賴電泳的RCA產物的直接膠染色，將節省電泳的操作和時間，有利于其快速檢測的實現。

核酸的電泳凝膠的銀染色是一種高靈敏的肉眼凝膠顯色法。可以用于凝膠中的核酸分子的肉眼檢測。然而該方法不僅需要長時間的電泳操作，而且電泳后凝膠染色時，需要將凝膠置于較大的染色容器中操作，各種銀染色試劑的使用量較大，而且換液時需防止凝膠的損壞，其換液操作十分不便。因此，不依賴電泳的固定凝膠的小體積染色操作將十分方便快捷。

發明內容

本發明針對上述現存的技術問題提出一種用于RCA肉眼檢測的管底固定凝膠的快速銀染色方法，通過該方法可以實現RCA的簡便、快捷、肉眼、定性或半定量的檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種用于RCA擴增產物的快速銀染色方法，該方法包括如下步驟：進行RCA擴增反應，反應結束后，將待檢測RCA擴增產物和凝膠加入反應管內，待凝膠在管底凝固后，依次向管中加入加入和移除各種銀染色的固定液，染色液，清洗液和顯色液，經孵育后，獲得管底凝膠中RCA產物的銀染色的顯色結果。

所述的待檢測的RCA擴增產物是任何基于RCA擴增的技術或RCA衍生技術所擴增產生的單鏈或雙鏈核酸產物。

所述的凝膠是能夠用于核酸鑒定的電泳固相支持凝膠，優選聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠。

所述的管是化學反應的各種反應管，優選EP管，塑料或玻璃試管。

所述的銀染色方法能夠進行核酸染色的銀染法，優選酸性銀染法。

所述的在管中加入或移出試劑的操作能夠使用微量移液器或直接傾倒的方法進行。

申請人通過研究發現，RCA產物檢測對電泳分離的要求不高，非電泳的直接凝膠銀染色檢測RCA產物較傳統電泳法有很大優勢，而且較其他的RCA檢測技術也具有一定優勢。在此，申請人提出了管底固定凝膠的銀染方法，用于RCA的分析，實現了RCA的非電泳，快速，方便，肉眼的檢測。