[發明專利]檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR引物探針組、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201711095505.0
• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107663543B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 孫端方;孫棣;肖洋;董睿;李春宇;田志強;張謙;黃家瑞
• 申請（專利權）人: 貴州省產品質量檢驗檢測院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識產權代理事務所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛君

1.檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR引物探針組，其特征在于：包括針對雞、鴨、鵝源性成分的三重引物探針組A和針對鵪鶉、鴿子、石雞源性成分的三重引物探針組B；

所述三重引物探針組A包括通用上游引物Seq.ID No.1、通用下游引物Seq.ID No.2、雞源性探針Seq.ID No.3、鴨源性探針Seq.ID No.4、鵝源性探針Seq.ID No.5；

所述三重引物探針組B包括鵪鶉上游引物Seq.ID No.6、鵪鶉下游引物Seq.ID No.7、鴿子上游引物Seq.ID No.8、鴿子下游引物Seq.ID No.9、石雞上游引物Seq.ID No.10、石雞下游引物Seq.ID No.11、鵪鶉源性探針Seq.ID No.12、鴿子源性探針Seq.ID No.13、石雞源性探針Seq.ID No.14；

所述雞源性探針的5’端用FAM修飾，所述鴨源性探針的5’端用HEX修飾，所述鵝源性探針的5’端用TAMRA修飾，所述鵪鶉源性探針的5’端用FAM修飾，所述鴿子源性探針的5’端用HEX修飾，所述石雞源性探針的5’端用TAMRA修飾，所述探針的3’端分別用NFQ-MGB修飾。

2.檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR試劑盒，其特征在于：包括權利要求1所述的引物探針組、熒光PCR試劑、陽性對照、陰性對照、空白對照。

3.根據權利要求2所述的檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述通用上游引物和通用下游引物的濃度分別為30μmol/L；所述鵪鶉上游引物、鵪鶉下游引物、鴿子上游引物、鴿子下游引物、石雞上游引物和石雞下游引物的濃度分別為10μmol/L，所述雞源性探針、鴨源性探針、鵝源性探針、鵪鶉源性探針、鴿子源性探針和石雞源性探針的濃度分別為10μmol/L。

4.根據權利要求2所述的檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述陽性對照為用權利要求1中包含的引物組進行擴增，并用權利要求1中包含的探針組檢測的混合DNA片段或基因組，濃度為10⁵copies/μL級。

5.根據權利要求2所述的檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR試劑盒，其特征在于：所述陰性對照為非禽源性DNA。

6.檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)進行樣品前處理，提取樣品DNA；

2)建立包括權利要求1所述的三重引物探針組A和三重引物探針組B的多重熒光PCR反應體系，反應條件為：95℃20-120s或10-15min；95℃5-60s，60℃20-120s；40循環并收集熒光信號，根據熒光信號變化進行禽源性成分檢測結果的判斷。

7.根據權利要求6所述的檢測六種禽源性成分的三重熒光PCR方法，其特征在于：所述檢測結果的判斷方法包括：

①質控標準：陽性對照的三重引物探針組A和三重引物探針組B的PCR反應體系中，FAM、HEX、TAMRA均有熒光對數增長，且Ct值≤30.0，陰性對照和空白對照均無熒光信號和對數增長，且Ct值≥40.0，進行②的禽源性成分檢測結果的判斷；

②樣品檢測結果的判斷：樣品的三重引物探針組A的PCR反應體系中，FAM和/或HEX和/或TAMRA有熒光對數增長，且Ct值≤30.0時，則含有相應的雞和/或鴨和/或鵝源性成分；樣品的三重引物探針組B的PCR反應體系中，FAM和/或HEX和/或TAMRA有熒光對數增長，且Ct值≤30.0時，則含有相應的鵪鶉和/或鴿子和/或石雞源性成分；若上述一種或幾種熒光無信號及對數增長，則不含相應的禽源性成分；若30.0Ct值40.0時，增加模板量復檢，Ct值≥40時，則檢測結果為陰性，Ct值40時，則檢測結果為陽性。