[發明專利]綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體及構建方法和應用

有效

• 申請號: 201711095491.2
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107760718B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 翟博;趙玉民;王春昕;張立春;趙云輝;郎洪彥;呂智超;曹陽;武斌;趙卓
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/66
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 王闖

本發明涉及基因工程技術領域，具體而言，提供了一種綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體及構建方法和應用。本發明提供的綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體，含有雙熒光素酶報告基因載體和CNKSR2基因的3’UTR區序列片段，該重組載體可以穩定表達綿羊CNKSR2基因，作為一個生物模塊用于各種相關技術領域；本發明提供的構建方法操作簡便，可以通過篩選基因準確得到帶有目的基因的重組載體，并且重組載體可以穩定表達目的基因；本發明提供的重組載體可以用于檢測CNKSR2基因表達活性，同時篩選得到靶向調控CNKSR2基因的miRNA?21，miRNA?21負調控抑制CNKSR2基因表達。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體而言，涉及一種綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體及構建方法和應用。

背景技術

動物皮毛的生長極為復雜，受到遺傳、外界環境、代謝、營養等各種因素的影響。遺傳因素作為皮毛生長的決定性因素，許多基因都直接或者間接的影響動物毛發生長，研究發現CNKSR編碼一個新的參與Ras信號通路調節的蛋白CNK，CNKSR同源序列之一的CNKSR2在人腦組織和皮膚組織中表達，由CNKSR2編碼表達的蛋白質被命名為CNK2，CNK2具有多個結構域，作為接頭蛋白參與MAPK信號通路的調節。其中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是真核細胞轉導細胞外信號到細胞內并引起細胞反應的一類重要的信號通路，從而影響細胞的生長、增殖和分化，對動物毛發的生長和發育有著重要的作用。眾多研究顯示，與毛囊生長發育有關的200多種分子中，MAPK信號傳導途徑占到分子總數的19.53％。

MicroRNA(即miRNA)是由18-25個核苷酸組成的一類內源性、短序列非編碼單鏈RNA，它由DNA轉錄產生，不翻譯蛋白質，通過和mRNA3'UTR區結合來調控目標基因的表達。miRNA主要是通過5'端被稱為種子序列的7nt序列與位于靶mRNA3'UTR的miRNA調控元件相互作用以識別靶mRNA。作為一種轉錄后調控小分子RNA，在動物中主要通過與靶mRNA的3'UTR區特異性互補配對，抑制靶mRNA翻譯或引起靶mRNA的降解，從而參與調控細胞分化、組織發育、腫瘤發生發展等多種生命過程。成熟的miRNA可同時封閉多個靶基因的翻譯，干預調節miRNA可改變多個靶基因的表達水平，且干預調節效率很高。miRNA作為轉錄后基因調控的一種方式，在生物體內形成一個調控網絡，由于miRNA調控涉及的方便廣，調控控作用明顯，本身序列短，便于操作和研究，越來越受到人們對其生物學功能研究的重視。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體，本發明的第二目的在于提供上述綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體的構建方法，本發明的第三個目的在于提供上述綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體在檢測綿羊CNKSR2基因表達活性中的應用，本發明的第四個目的在于提供綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體在篩選調控綿羊CNKSR2基因的microRNA上的應用，本發明的第五個目的在于提供上述綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體在檢測microRNA調控綿羊CNKSR2基因的調控機制中的應用，以緩解現有技術中對綿羊CNKSR2基因的調控機制的研究內容和方法不完善的問題，提供一種綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體及構建方法，同時預測調控綿羊CNKSR2基因的miRNA。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

本發明提供了一種綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體，所述綿羊CNKSR2基因雙熒光素酶報告基因載體含有雙熒光素酶報告基因載體和CNKSR2基因的3’UTR區核苷酸序列片段。

進一步地，所述雙熒光素酶報告基因載體為pmiR-RB-REPORT^TM。