[發(fā)明專利]PDGFRA基因突變檢測體系及其試劑盒

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• 申請日: 2017-11-09
• 公開（公告）號: CN107904290A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 王明;趙國玲
• 申請（專利權）人: 上海賽安生物醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886
• 代理公司: 上海海頌知識產權代理事務所(普通合伙)31258
• 代理人: 任益

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測PDGFRA基因突變的方法和檢測產品，屬于生物技術領域。

背景技術

研究已經發(fā)現(xiàn)在多種人類癌癥(胃腸道間質瘤、膠質母細胞瘤、惡性外周神經鞘等腫瘤)中存在PDGFRA的擴增、缺失、及體細胞突變，研究發(fā)現(xiàn)，PDGFRA的突變不僅與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，而且與腫瘤的分期、分級及預后也有密切關系。因此，檢測腫瘤患者不同階段中PDGFRA突變，對患者判斷預后有著重要的意義

探索患者PDGFRA耐藥機制及預測預后成為一條可行的途徑，現(xiàn)在已經明確腫瘤細胞會釋放DNA進入循環(huán)系統(tǒng)，使得通過“液態(tài)活檢”的方式，能夠對早期及晚期腫瘤患者特定的核酸序列進行分析，是一種非侵入性的檢測腫瘤基因及臨床治療效果的一種方法，而且患者對非侵入性樣本采集方式的接受度更高。

但是由于大多數(shù)人血清/血漿中cfDNA含量低，在腫瘤早期階段，ctDNA僅占總游離DNA的0.01％，且cfDNA片段相對小等原因，目前對腫瘤相關基因的臨床檢測主要是測序法和ARMS法，并不適用。使用靈敏度較低的常規(guī)方法檢測只能發(fā)現(xiàn)小部分患者在接受特定治療前的腫瘤變異，采用高靈敏度法(如dPCR)檢測則可以發(fā)現(xiàn)較高比例的攜帶突變型患者。目前進行PDGFRA基因突變檢測的方法主要有芯片技術、探針引物技術、酶切、焦磷酸測序技術和HRM分析技術等，價格貴、繁瑣或準確性不高。因此，開發(fā)一種檢測PDGFRA基因突變的產品，以實現(xiàn)更高靈敏度、更低成本、更方便快捷的PDGFRA基因突變檢測是非常有必要的。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種靈敏度和特異性高，樣品需求量少，可以快速便捷準確地進行PDGFRA基因突變檢測的PDGFRA基因突變檢測體系及其試劑盒。

本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種PDGFRA基因突變檢測體系，包括用于檢測PDGFRA基因第12外顯子V516D位點的上下游引物A，用于PDGFRA基因檢測第18外顯子D842V位點的上下游引物B，熒光染料SYBR GreenI，以及肽核酸；

所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述肽核酸包括核苷酸序列與野生型PDGFRA基因第12外顯子V516D位點完全互補且核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列與野生型PDGFRA基因第18外顯子D842V位點完全互補且核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的肽核酸B。

上述上下游引物A、B進行了LNA修飾。

上述上下游引物A、B在反應體系中的最終濃度均為0.1～0.3μM/L。

上述上下游引物A在反應體系中的最終濃度為0.19μM/L，所述上下游引物B在反應體系中的最終濃度為0.2μM/L。

上述肽核酸A、B在反應體系中的最終濃度均為1～1.5μM/L。

上述肽核酸A、B在反應體系中的最終濃度均為1.25μM/L。

本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種采用上述的檢測體系的PDGFRA基因突變檢測產品。

本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種PDGFRA基因突變檢測試劑盒，包括PCR檢測液A、PCR檢測液B和SYBR GreenI混合液；

所述PCR檢測液A包括用于檢測PDGFRA基因第12外顯子V516D位點的上下游引物A和肽核酸A，所述PCR檢測液B包括用于檢測PDGFRA基因第18外顯子D842V位點的上下游引物B和肽核酸B；

所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，

所述肽核酸包括核苷酸序列與野生型PDGFRA基因第12外顯子V516D位點完全互補且核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的肽核酸A，以及核苷酸序列與野生型PDGFRA基因第18外顯子D842V位點完全互補且核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的肽核酸B。

上述上下游引物A、B進行了LNA修飾；所述上下游引物A、B在反應體系中的最終濃度均為0.1～0.3μM/L，所述肽核酸A、B在反應體系中的最終濃度均為1～1.5μM/L。