[發明專利]一種PCV2 Cap標記蛋白的重組昆蟲桿狀病毒表達載體的構建方法

在審

• 申請號: 201711093013.8
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN108179155A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 徐國;曾智勇;梁海英;代振江
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;C12N15/34
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

本發明公開了一種豬圓環病毒二型Cap標記蛋白的重組昆蟲桿狀病毒表達載體的構建方法，其特征在于：包含以下步驟：(1)將PCV2GZ?RH1株全基因克隆至pMD19?T載體，設計引物以重組T載體為模板通過PCR技術將V5Tag或Flag Tag標簽引入至PCV2的ORF2末端；(2)將攜帶標簽的ORF2亞克隆至pFastBacHTA、pFastBacDual供體質粒，將亞克隆所得的陽性質粒轉化入DH10Bac感受態細胞進行Bacmind桿粒的制備；(3)將Bacmind桿粒轉染昆蟲細胞，獲得重組昆蟲桿狀病毒，重組昆蟲桿狀病毒擴增至P3代病毒。

技術領域

本發明涉及一種重組桿狀病毒毒株的構建，也涉及了一種PCV2的Cap重組標記蛋白表達，故本發明中涉及重組桿狀病毒毒株的構建及其表達的重組標記蛋白在PCV2診斷、預防中的應用，隸屬生物技術領域獸醫生物制品研制方面。

背景技術

豬圓環病毒(Porcinecircovirus,PCV)是一種無囊膜的小型單鏈環狀DNA病毒，系環狀病毒科、圓環病毒屬成員，基因組大小在1800bp左右。根據致病性、抗原性和基因結構等的差異，豬圓環病毒一般分為圓環病毒1型(PCV1)和圓環病毒2型(PCV2)。PCV1臨床不致病，而PCV2感染可導致多種臨床疾病，能引起豬只發生皮炎腎病綜合征、斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、肉芽腫性腸炎和母豬繁殖障礙等一系列相關綜合侯群，也稱圓環病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)，PCVD給養豬業造成巨大經濟損失。

PCV2的基因組共編碼11個開放閱讀框架(Open reading frames，ORFs)，其中功能上重要的是ORF1和ORF2。ORF2編碼病毒的核衣殼(Cap)蛋白，是病毒的唯一結構蛋白，同時也是病毒主要的免疫原性蛋白，可以刺激機體產生中和性抗體。因此，關于PCV2基因工程疫苗的研究基本集中在ORF2基因。至今，疫苗免疫仍然是防控PCV2最主要的手段，國內市場上的疫苗主要為滅活苗，目前的疫苗所產生抗體不能與野毒抗體相區別等缺陷。為了能區分疫苗產生的抗體和野毒產生的抗體，國外的Beach和我國的黃立平等，分別將GLU、KT3標簽和V5標簽插入到PCV2 ORF2的末端，構建了攜帶分子標記的毒株，該毒株既能產生Cap蛋白又能產生標簽蛋白，利用標簽抗體作為檢測抗體能夠將標簽毒株和親本毒株區分開來(Beachetal.,2011；黃立平，2013)。然而他們在引入標簽中用的融合PCR方法，至少使用了3對引物，操作過程繁瑣，且耗時費力。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：通過基因工程技術向特定基因位點引入可遺傳的標記，將重組基因克隆至桿狀病毒載體。其次，提供一種桿狀病毒重組毒株，重組毒株在昆蟲細胞中所表達的Cap標記蛋白具有良好的免疫原性，可作為PCV2亞單位疫苗和PCV2特異性抗體診斷的抗原。

本發明的技術方案是：一種豬圓環病毒二型Cap標記蛋白的重組昆蟲桿狀病毒表達載體的構建方法，包含以下步驟：(1)將PCV2 GZ-RH1株(GenBank登錄號：JQ809464)全基因克隆至pMD19-T載體，設計引物以重組T載體為模板通過PCR技術將V5Tag或FlagTag標簽引入至PCV2的ORF2末端；(2)將攜帶標簽的ORF2亞克隆至pFastBacHTA、pFastBacDual供體質粒，將亞克隆所得的陽性質粒轉化入DH10Bac感受態細胞進行Bacmind桿粒的制備；(3)將Bacmind桿粒轉染昆蟲細胞，獲得重組昆蟲桿狀病毒，重組昆蟲桿狀病毒擴增至P3代病毒。

所述的引物為引物對F2/R2；F2、R2的基因序列如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5所示；

Seq ID NO.4：5′-GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′；