[發明專利]一種合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201711092675.3
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107805622B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;堵國成;鄧潔瑩;陳春梅;李江華
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/32;C12R1/125
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 張偉樸

本發明提供了一種合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用，所述重組芽孢桿菌是通過強化表達枯草芽孢桿菌168的糖轉運蛋白基因，并表達外源巖藻糖激酶和磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因得到的。本發明通過改造枯草芽孢桿菌168獲得了可高效合成合成鳥苷二磷酸巖藻糖的菌株，其胞內積累量高達156mg/L。本發明通過加強表達了糖轉運蛋白基因，可以有效強化糖轉運蛋白的表達，提高了外源巖藻糖轉移至胞內的效率，增加了胞內巖藻糖的濃度，促進了鳥苷二磷酸巖藻糖的合成。本發明的重組枯草芽孢桿菌構建方法簡單，便于使用，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于遺傳工程的技術領域，具體涉及一種合成鳥苷二磷酸巖藻 糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

母乳中含有重要營養成分，生物活性物質，刺激腸道菌群生長的因子。 其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在許多生理功能上 起到了關鍵的作用，例如促進雙歧桿菌生長，病原體感染的抑制作用，和 提高免疫反應。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能 如其作為腸道致病菌的受體類似物的能力、促進免疫調節的能力和減少炎 癥的能力，已經獲得了極大的關注。因為藻糖基化的寡糖是由巖藻糖基轉 移酶催化進行糖類巖藻糖基化而成，這就需要鳥苷二磷酸巖藻糖 (GDP-L-fucose)作為巖藻糖基的供體。隨著巖藻糖基化的寡糖的熱度越 來越高，許多制藥公司試圖通過化學方法和生物方法合成充足的 GDP-L-fucose。在化學合成中，GDP-L-fucose以L-巖藻吡喃糖基四乙酸 為起始原料，由HBr、Ag₂CO₃、N-四丁銨磷酸二甲苯酯等物質引發的化 學反應。GDP-L-fucose是可拉酸的前體，可拉酸是革蘭氏陰性菌細胞壁的 主要成分，因此，一些腸道細菌如大腸桿菌和沙門氏菌能在體內合成 GDP-L-巖藻糖。在生物中發現了兩種合成GDP-L-fucose的代謝途徑：補 救途徑和從頭途徑。

補救途徑是在人類的代謝途徑中發現的，外源的巖藻糖轉移到胞內， 由巖藻糖激酶消耗ATP磷酸化(EC 2.7.1.52)形成巖藻糖-1-磷酸 (Fuc-1-P)。Fuc-1-P結合鳥苷三磷酸(GTP)在巖藻糖-1-磷酸鳥苷酰基 轉移酶(L-fucose-1-phosphate guanylyltransferase)(EC 2.7.7.30)的催化 下生成GDP-L-巖藻糖。從頭合成途徑普遍存在于原核生物和真核生物中， 其中GDP-L-fucose是由GDP-甘露糖通過甘露糖脫氫酶(GMD，EC 4.2.1.47)和GDP-巖藻糖合成酶(WCAG，EC 1.1.1.271)催化合成的。其 中有代表性的反應方法如圖2所示。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要 營養化學品的生產宿主，其產品被FDA認證為“generally regarded as safe” (GRAS)安全級別。

因此，如何利用枯草芽孢桿菌，通過生物方法高效合成鳥苷二磷酸巖 藻糖，仍是本領域亟待解決的問題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種合成鳥苷二磷酸 巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用，構建的重組枯草芽孢桿 菌可以高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖。

具體的，一方面，本發明提供了一種合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯 草芽孢桿菌，所述重組芽孢桿菌是通過強化表達枯草芽孢桿菌168的糖轉 運蛋白基因，并表達外源巖藻糖激酶和磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因得到的。

枯草芽孢桿菌168的糖轉運蛋白基因是不表達的，通過強化表達枯草 芽孢桿菌168的糖轉運蛋白基因，并表達外源巖藻糖激酶和磷酸鳥嘌呤基 轉移酶基因，提高了外源巖藻糖轉移至胞內的效率，增加了胞內巖藻糖的 濃度，促進了鳥苷二磷酸巖藻糖的合成。