[發(fā)明專利]一種穩(wěn)定表達豬源cGAS受體基因的NF?κB雙熒光素酶報告細胞及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711089723.3
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107603954A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱建中;周榮云;李雙潔;何姍;朱美芹
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/65;C12R1/91
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種穩(wěn)定表達豬源cGAS受體基因的NF-κB雙熒光素酶報告細胞系，其特征在于，是指轉(zhuǎn)入了豬源cGAS受體基因(pcGAS)的HEK293-NF-κB細胞，所述HEK293-NF-κB細胞是引入了NF-κB蟲熒光素酶和內(nèi)參海腎熒光素酶的HEK293細胞。

2.一種穩(wěn)定表達豬源cGAS受體基因的NF-κB雙熒光素酶報告細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)含pcGAS編碼區(qū)基因的pcDNA真核表達載體的構(gòu)建

設(shè)計PCR引物，從豬原代肺泡巨噬細胞PAM的RNA中RT-PCR擴增pcGAS編碼基因，擴增PCR片段經(jīng)雙酶切后和帶有C-端HA表達標(biāo)簽的Gateway pENTR4中間入門載體相連接；得到的含pcGAS的pENTR4重組質(zhì)粒和目的pcDNA表達載體pDEST47進行位點特異重組反應(yīng)，獲得陽性重組pcDNApcGAS表達克隆；

(2)HEK293-NF-κB雙熒光素酶穩(wěn)定報告細胞的構(gòu)建：

培養(yǎng)人胚腎細胞HEK293至融合度70％-80％，利用表達NF-κB蟲熒光素FLuc的慢病毒感染HEK293細胞，感染細胞用10μg/ml殺稻瘟菌素篩選獲得穩(wěn)定表達NF-κB報告基因的HEK293細胞系；兩次有限稀釋法亞克隆，細胞克隆用TNF-α刺激細胞6-8小時，篩選對TNF-α刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平NF-κB活化，高表達FLuc的單細胞克隆；上述細胞克隆用質(zhì)粒TK海腎熒光素酶RLuc和pBabe Hygro共轉(zhuǎn)染，細胞經(jīng)100μg/ml的潮霉素B篩選后獲得穩(wěn)定表達細胞；細胞再經(jīng)過有限稀釋法亞克隆，單個細胞克隆用不同濃度TNF-α刺激，選取對TNF-α刺激具有高水平FLuc應(yīng)答同時穩(wěn)定高表達RLuc的細胞克隆；

(3)pcGAS-HEK293-NF-κB穩(wěn)定表達細胞系的構(gòu)建：

培養(yǎng)HEK293-NF-κB雙熒光素酶報告細胞至融合度70％-80％，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin2000將含有pcGAS基因的質(zhì)粒pcDNApcGAS轉(zhuǎn)染入HEK293-NF-κB細胞，經(jīng)800μg/ml的G418篩選后獲得表達pcGAS編碼基因的HEK293-NF-κB細胞，經(jīng)三輪細胞刺激鑒定篩選及擴大培養(yǎng)、獲得穩(wěn)定表達pcGAS基因的HEK293-NF-κB雙熒光素酶報告細胞系。