[發(fā)明專利]一種人糞便樣本中脫落細胞DNA的提取試劑盒及提取方法

有效

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• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107760675B
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發(fā)明（設計）人: 李明;楊俊;陸穎鍶;韓麗娜;黃曦;何金津;周進生;丘遠輝
• 申請（專利權）人: 泰州達安達瑞醫(yī)學檢驗有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 32243 南京正聯(lián)知識產權代理有限公司
• 代理人: 盧霞

本發(fā)明提供了一種人糞便樣本中脫落細胞DNA的提取試劑盒，其特征在于，包括如下試劑：1）樣本保存液SPB；2）細胞捕獲劑CCB；3）細胞裂解液I；4）DNA提取液I；5）DNA溶解液EB；6）無水乙醇和75%乙醇。本發(fā)明還提供了使用試劑盒用于人糞便樣本中脫落細胞DNA的提取方法。本發(fā)明有以下優(yōu)勢和應用價值：1.樣本采樣簡便、無創(chuàng)、個性便捷，無需專人協(xié)助取樣，可自行取樣；糞便樣本取樣簡單（無需取糞便樣本硬性要求的特定位置，隨機取成型的糞便樣本即可），取人者可自行取樣，無需到醫(yī)院由專業(yè)人士協(xié)助取樣，便捷、非侵入、取樣者體驗友好。2.樣本保存方便：常溫放置即可；3.樣本預處理簡單：無需做離心淘洗法、密度梯度離心法、及免疫磁珠法等處理。

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)學生物領域中核酸(DNA)的提取方法，具體涉及從人類糞便中提取脫落細胞DNA的方法及應用。

背景技術

糞便是食物經口咀嚼，經食道到達胃后，通過胃的消化，進入十二指腸，同時在膽汁與胰液的共同作用下，經小腸消化和吸收后，最終大腸中形成的殘渣排泄物。糞便是保持機體內環(huán)境穩(wěn)定的最終代謝產物，除了含有水、蛋白質、無機物、脂肪、未消化的食物纖維外，還含有細菌細胞、病毒及器官的表皮脫落細胞等。糞便中的細菌主要來源于腸道菌群或者少量來源于食物；器官的表皮脫落細胞主要來源于大腸。糞便中不但蘊藏著豐富的生物學信息，且具有非侵入性、無創(chuàng)、采樣便捷、來源廣泛等優(yōu)點。糞便的成分及含量的改變不僅受消化系統(tǒng)的影響，而且與血液循環(huán)、代謝、呼吸等系統(tǒng)的生理或病理變化有關。從糞便樣本中分離出總核酸，并對這些核酸序列進行分子檢測(電泳分析、Q-PCR、Sanger及NGS等技術)，可以幫助對腫瘤、腸道微生物、艾滋病、瘧疾等潛在的重大疾病的早期、無創(chuàng)的分子檢測。

由于糞便中的脫落細胞含量很低，采用常規(guī)的核酸提取方法難以從糞便脫落細胞中獲取足量且高質量的核酸。糞便的放置條件、放置的時間等條件都會影響糞便樣本中脫落細胞的完整性，進而影響提取核酸時的回收率。為了從糞便中以高回收率獲取高質量的核酸，通過采用樣本保存液常溫保存樣本和脫落細胞濃縮捕獲方法，從而簡化樣本采樣和保存流程、縮短樣本預處理時間，非常方便實際科研和生產的應用。

在采用離心柱法提取核酸時，通常將樣品離心通過吸附柱，使樣品中的核酸在高鹽條件下結合到吸附柱的硅膠模上。然而這樣的上樣方法對于核酸含量低、樣品量較大的糞便樣本液而言，不但需要大量的提取試劑，而且上量離心時間過長，不利于核酸的提取。鑒于此難題，盡管近年來許多研究提出相應解決的方法如：離心淘洗法、密度梯度離心以及免疫磁珠法，但這些研究方法具有對糞便取樣要求苛刻、糞便樣本保存要求高、對耗材和設備要求高、操作流程繁瑣而耗時等的缺陷，另外市面上已有一些糞便DNA提取試劑盒不但不能完全解決這些難題，而且最終提取DNA的實際質量并不能達到官方公開的指標，另外價格也比較昂貴，難以實現(xiàn)在分子檢測的應用。因此針對糞便中核酸含量低、提取核酸時所需樣本量較大的情況下，發(fā)明一種從糞便中快速富集并提取核酸的方法，將對臨床糞便樣本進行無創(chuàng)的分子檢測具有重要的應用價值。本發(fā)明提供了糞便樣本保存液和脫落細胞富集捕獲的簡易方法，可將大量的糞便樣本濃縮處理后，快速富集至核酸吸附柱上，再經洗滌、洗脫步驟提取出高質量的核酸，可用于分子檢測。

發(fā)明內容

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術所存在不足之處開展的實驗研究，目的在于提供一種快速簡易、低成本、穩(wěn)定性和重復性高的從糞便中提取人基因組DNA試劑盒及提取的方法。

本發(fā)明的人類糞便DNA提取方法，其實質是自糞便中提取排便人的腸道上皮脫落細胞的DNA，所要解決的技術是不僅能使DNA完整從細胞中釋放出來，并且保證在常規(guī)一系列的分離、沉淀和純化技術過程中不被破壞，從而得到濃度和純度較高的人基因組DNA樣本。

本發(fā)明的糞便脫落細胞提取試劑盒，包括如下試劑：1)樣本保存液SPB；2)細胞捕獲劑CCB；3)細胞裂解液I；4)DNA提取液I；5)DNA溶解液EB；6)無水乙醇和75％乙醇。