[發明專利]一種采用響應面法快速優化金屬離子促進芽孢桿菌產孢的方法

有效

• 申請號: 201711085131.4
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107955829B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 郭小華;任航;蘇雅婷
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12N3/00;G01N21/64;C12R1/07
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種采用響應面法快速優化金屬離子促進芽孢桿菌產孢的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）單因子試驗設計：在基礎培養基的基礎上，分別選取不同的可能對芽孢生成起到促進作用的金屬離子，分別改變其在發酵液中的最終摩爾濃度，經過36 h-60 h發酵培養后，用移液器取其芽孢懸液1毫升，洗滌該芽孢懸液，用于芽孢DPA熒光強度的檢測；

（2）芽孢懸液的處理及熒光檢測：將芽孢懸液洗滌后重懸，采用誘導芽孢萌發的方法促進重懸液中芽孢體內的DPA的完全釋放，離心后收集上清，對上清液用Tris-HCl緩沖液進行一定比例的梯度稀釋，測定其熒光強度；將上清液稀釋后與EuCl₃和環己二胺四乙酸充分混合均勻，采用熒光分光光度計測定上述混合溶液的熒光強度，測定過程中激發波長范圍260~280 nm，發射波長范圍610~630 nm；

（3）顯著性因子的篩選：以芽孢DPA熒光強度為響應值，對單因子試驗設計中能影響到芽孢發酵的金屬離子進行篩選，選取離子濃度改變時對熒光強度產生顯著增強的金屬離子類型及其最適的添加濃度；

（4）采用中心組合設計，確定金屬離子的組合效應，實現在一定的離子濃度組合情況下芽孢產量的最大化：根據單因子試驗設計的實驗結果，以顯著正效應的金屬離子及其最大熒光強度效應時的濃度作為響應面優化實驗因素的中心點，采用統計軟件Box-Benhnken設計或者中心組合設計進行實驗設計，以芽孢釋放產生的DPA熒光強度作為響應值，對響應面模型進行方差分析，確定離子組合效應及對芽孢發酵產生的DPA熒光強度最大值；

所述芽孢桿菌為解 淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens BS-20，所述解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens BS-20 已于2017 年10 月17 日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC： M 2017587，分類命名為解淀粉芽孢桿菌BS-20（BacillusAmyloliquefaciensBS-20）。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中該芽孢懸液的洗滌包括：將移取的1毫升芽孢懸液于6000rpm下離心10分鐘后，用緩沖液重懸到該緩沖液中再于6000rpm下離心10分鐘，重復上述的重懸、離心步驟。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中芽孢懸液芽孢萌發的方法為物理方法，具體為滅菌、微波處理或超聲破碎；或者為化學誘導劑混合培養法，所述化學誘導劑具體為肌苷、L-丙氨酸、溶菌酶或吡啶二羧酸鈣。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述誘導芽孢萌發的方法具體為高溫高壓滅菌法，包括：將重懸液置于密閉容器中，然后置于高壓滅菌鍋內在不低于100℃的溫度下處理10分鐘以上。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述化學誘導劑混合培養法包括：用100mM的誘導劑在200rpm下振蕩3 h以上，懸浮芽孢以制成芽孢懸液。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：步驟（2）中稀釋后的上清液、EuCl₃和環己二胺四乙酸三者的體積比為1：4.5：4.5；其中EuCl₃和環己二胺四乙酸均采用緩沖液配制成濃度為2 mM。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟（2）中熒光強度檢測條件參數為：掃描速度3000 nm/min，EX狹縫10.0 nm，EM狹縫5.0 nm，光電倍增管電壓700 V，響應0.08 s。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟（4）中所采用的統計軟件為DesignExpert、JMP或Statistica軟件。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：步驟（1）~（4）中，所述的緩沖液為50 mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液；所述的金屬離子包括銅離子、鐵離子、鈣離子、錳離子和鎂離子。