[發(fā)明專利]一種表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711083981.0
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107904182A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁偉凡;周玉巖;李洪金;丁小云;林綠淼;丘春尚
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東海納川生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/66;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 深圳市君勝知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44268
• 代理人: 王永文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母。

背景技術(shù)

死亡素(Thanatin，THA)，又稱死亡肽，是在昆蟲斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中發(fā)現(xiàn)的，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗菌譜最廣的抗菌肽之一，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌有殺滅活性，而且對某些真菌也有抑制作用，同時對哺乳動物細(xì)胞不表現(xiàn)出溶血性，是抗生素的潛在替代品。死亡素由21個氨基酸殘基組成，在第11位和第18位含Cys殘基，可形成分子內(nèi)的二硫鍵，該二硫鍵對死亡素的穩(wěn)定性起到重要作用。核磁共振及分子動力學(xué)模擬死亡素在水溶液中的三維結(jié)構(gòu)，死亡素分子從第8位殘基到C末端可形成標(biāo)準(zhǔn)的β-反向平行折疊結(jié)構(gòu)，N端結(jié)構(gòu)高度可變，分子內(nèi)有4個區(qū)域與其活性密切相關(guān)。死亡素抑菌的最小肽段由C端環(huán)和相鄰殘基組成，C末端Met殘基的酰氨化對其抗菌活性是必要的。通過對其截短類似物以及死亡素的抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，死亡素可能通過多種機制對微生物產(chǎn)生影響，其作用方式可能是引起細(xì)菌凝集和阻斷細(xì)胞膜上的呼吸鏈，從而達(dá)到抑菌目的。

斑腹刺益蝽體內(nèi)死亡素含量非常低，通過提取的方法制備死亡素是非常昂貴的。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)死亡素會是一種比較經(jīng)濟的方法。中國專利CN102241778B、CN102863539B、CN103641901B及其發(fā)表的相關(guān)論文報道了利用大腸桿菌進行死亡素與其他蛋白融合表達(dá)的方法，破碎細(xì)胞后檢測融合蛋白具有抑菌活性。沈子龍等報道了利用裂殖酵母胞內(nèi)表達(dá)死亡素，破碎細(xì)胞后能檢測出抑菌活性。徐濤等報道了利用畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)掌葉半夏凝集素（PPA）和死亡素的融合蛋白，檢測發(fā)現(xiàn)融合蛋白沒有抑菌活性。上述利用微生物表達(dá)死亡素的案例中，死亡素的表達(dá)量低，且是胞內(nèi)表達(dá)，后續(xù)需要破碎細(xì)胞才能得到死亡素，增加生產(chǎn)成本。

可見，現(xiàn)有技術(shù)還有待改進和提高。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)Thanatin抗菌肽的畢赤酵母，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中死亡素表達(dá)量低，生產(chǎn)成本高的問題，實現(xiàn)死亡素的大量表達(dá)，降低生產(chǎn)成本。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母,其中，所述的重組Thanatin抗菌肽包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的畢赤酵母包括畢赤酵母X33、畢赤酵母GS115和畢赤酵母SMD1168中的一種。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的畢赤酵母為畢赤酵母X33。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的載體骨架為pPICzαA。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的Thanatin抗菌肽的表達(dá)載體為pPICzαA-THA。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的表達(dá)載體pPICzαA-THA的構(gòu)建包括以下步驟：

S001、在Thanatin抗菌肽的基因5’端添加XhoI酶切位點和Kex2切割位點CTCGAGAAAAGA,在Thanatin抗菌肽的基因3’端添加XbaI酶切位點TCTAGA，合成后得到克隆載體pUC-THA；

S002、XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶雙酶切處理步驟S001中得到的pUC-THA克隆載體，得到Thanatin基因片段；

S003、將步驟SOO2中得到的Thanatin基因片段連接至同樣被XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶雙酶切處理的pPICzαA載體，構(gòu)建得到表達(dá)載體pPICzαA-THA。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的表達(dá)載體pPICzαA-THA菌株的驗證引物為：

5AOX-F：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，

3AOX-R：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的重組Thanatin工程菌的篩選抗生素為0.25-4mg/mL的博來霉素。

所述的表達(dá)重組Thanatin抗菌肽的畢赤酵母中，所述的重組Thanatin抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)方法包括以下步驟：