[發明專利]一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法

在審

• 申請號: 201711082478.3
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN109750089A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 付世騫;馮曉涵;張紫薇;姜毓君;滿朝新
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 劉景祥

1.一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)待檢乳樣的前處理：向待檢乳中加入PMA，然后置于暗處進行預孵育，接著置于650W鹵素燈下照射曝光；本步驟操作均在冰浴上進行；

(2)樣品DNA的提取：向步驟(1)處理后的待檢乳中加入檸檬酸鈉和氫氧化鈉，然后離心，棄上清，得沉淀；

(3)用質量濃度為0.85％的生理鹽水洗滌沉淀，然后離心，棄上清，用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，得到提取物；

(4)以提取物作為模板進行LAMP擴增，得到LAMP擴增產物；

(5)鑒定：取LAMP擴增產物，點樣于質量濃度為2％的瓊脂糖凝膠中，以100V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳30min，然后在凝膠成像系統中成像，即完成檢測；若產生LAMP特異性擴增條帶，表明該待檢乳中含有單增李斯特活菌，若無LAMP特異性擴增條帶，表明該待檢乳中不含有單增李斯特活菌。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于步驟(1)中PMA的終濃度為50μM～200μM。

3.根據權利要求1所述的一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于步驟(1)中置于暗處預孵育5min～10min。

4.根據權利要求1所述的一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于步驟(1)中置于距650W鹵素燈20cm處照射。

5.根據權利要求1所述的一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于步驟(1)中曝光時間為5min～9min。

6.根據權利要求1所述的一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于步驟(2)中檸檬酸鈉和氫氧化鈉的終濃度分別為250g/L和1mol/L。

7.根據權利要求1所述的一種快速檢測乳中單增李斯特活菌的方法，其特征在于步驟(4)中LAMP擴增的反應體系為25μL，由下列成分組成：FIP引物(40μM)1μL，BIP引物(40μM)1μL，F3引物(5μM)1μL，B3引物(5μM)1μL，10×Buffer 2.5μL，dNTPs(10mM)4μL，MgSO₄(25mM)4μL，甜菜堿(12.5mol/L)2μL，Bst2.0 DNA酶(200U/μL)1μL，模板DNA 2μL，加入ddH₂0加至25μL；LAMP擴增條件為：63℃1h，80℃2min終止反應。