[發明專利]用液相色譜串聯質譜技術檢測兒茶酚胺及代謝產物的方法

在審

• 申請號: 201711081600.5
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN107966520A
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 汪純;楊紹杰
• 申請（專利權）人: 廣東中科康儀生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/96
• 分類號: G01N30/96;G01N30/72
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及化合物檢測領域技術，尤其是涉及一種用液相色譜串聯質譜技術檢測兒茶酚胺及代謝產物的方法。

背景技術

嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PPGL)是分別起源于腎上腺髓質的嗜鉻細胞或腎上腺外的交感神經節細胞的腫瘤。PPGL會分泌大量的兒茶酚胺，包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)及多巴胺(DA)，造成患者的血壓陣發性或持續性的升高。盡管PPGL患者只占普通高血壓患者的0.2％～0.6％，但是這些患者若未能及時得到針對性治療，長期的高血壓可對患者的心、腦、腎等器官造成嚴重損害。有些患者甚至會發生高血壓危象，危及生命。而患者若能在早期得到準確、及時的診斷，通過手術切除腫瘤，高血壓可得到治愈。傳統的PPGL生化檢查是檢測血或尿中的腎上腺素和去甲腎上腺素的濃度。然而，這類方法對PPGL診斷的靈敏度和特異性均不理想。為了解決上述問題，中華醫學會內分泌協會和美國內分泌協會推薦試用兒茶酚胺的代謝產物變腎上腺素(MN)和變去甲腎上腺素(NMN)作為診斷PPGL的首選指標。目前臨床中用于檢測變腎上腺素和變去甲腎上腺素的濃度的方法有酶聯免疫法、液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)、液相色譜電化學法，其中酶聯免疫法的靈敏度較低，電化學法易存在對目標峰的干擾。

由于腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)以及其代謝產物變腎上腺素(MN)、變去甲腎上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)均具有較高的極性，而且分子結構相近，這就對上述化合物的分離方法提出了較為苛刻的要求。盡管現有技術中報道過采用液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)分離上述化合物，但是一種液相色譜串聯質譜法通常只能分離上述6種化合物中的一部分化合物，不能將上述6種化合物一次性有效地分離。如果要想從生物樣品中檢測上述6種化合物來診斷PPGL，需要采用不同的液相色譜串聯質譜法的組合。這導致了檢測時間的過度延長，很大程度上抑制了其在臨床上的應用。因此，目前迫切需要一種能夠高效地從生物樣本中一次性檢測出上述兒茶酚胺及其代謝產物的方法。

發明內容

有鑒于此，本發明針對現有技術存在之缺失，提供了一種用液相色譜串聯質譜技術檢測兒茶酚胺及代謝產物的方法，該方法采用LC-MS/MS可以快速地檢測生物樣本中的腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、變腎上腺素(MN)、變去甲腎上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)和多巴胺(DA)，可以用于全面地診斷和排查各種類型的PPGL。

具體而言，本發明提供了一種用液相色譜串聯質譜技術檢測兒茶酚胺及代謝產物的方法，包括：

(1)將250μL的醋酸銨溶液、100μL的兒茶酚胺及其代謝產物的內標溶液、200μL的生物樣本，充分混勻后形成待測樣本溶液，待用；

(2)將N個濃度不同的200μL兒茶酚胺及其代謝產物的標準品溶液分別與250μL的醋酸銨溶液、100μL的兒茶酚胺及其代謝產物的內標溶液混勻形成N個標準品混合溶液，待用；其中N為4至10的整數，優選5至8的整數。

(3)將弱陽離子交換96孔固相提取板分別用200μL甲醇和水進行預處理；然后分別將以上混勻的樣品溶液和標準品溶液加載至經過預處理的各孔中，待樣品加載完成后，分別用200μL的醋酸銨溶液與乙腈/異丙醇混合液清洗樣品孔，然后用2份50μL的含有甲酸的乙腈水溶液洗滌樣品孔，并將洗脫液收集在接收板中；取10μL洗脫液進入LC-MS/MS系統分析；

其中，LC-MS/MS系統的色譜條件為：色譜柱為Xbridge BEH Amide，柱溫35℃；流動相A:100％水，含有10mM甲酸銨；流動相B：85％乙腈、15％水，含有10mM甲酸銨，流速：0.4ml/min；梯度洗脫；質譜條件為：電噴霧離子源，正離子掃描，離子源噴霧電壓：3600V，離子傳輸管溫度：350℃，霧化溫度：330℃。

將N個含有內標的兒茶酚胺及其代謝物的標準品混合溶液通過固相提取板處理，進入LC-MS/MS分析后，將標準品出峰面積同內標出峰面積的比值與標準品溶液濃度做線性回歸；得到6種化合物的標準曲線。然后，根據待測樣本中的6種化合物的出峰面積同內標出峰面積的比值，通過標準曲線計算生物樣本中6種目標化合物的濃度。其中，6種化合物分別是腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、變腎上腺素(MN)、變去甲腎上腺素(NMN)、3-甲氧酪胺(3-MT)和多巴胺(DA)

優選地，所述生物樣本是血漿。

所述兒茶酚胺及其代謝產物的標準品溶液包含：