[發明專利]一種dead SaCas9-Fok1系統及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201711081215.0
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN108148872A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 黃雨亭;祝海寶;羅思施;陶米林;梁福才;劉方方;唐憶琳
• 申請（專利權）人: 廣東赤萌醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22;A61K31/7105;A61K48/00;A61P31/18
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

本發明公開了一種dead SaCas9?Fok1系統及其構建方法與應用，由于SaCas9分子量小，p?dead SaCas9?Fok1重組質粒利用dead SaCas9替代傳統的dead SpCas9，降低SpCas9空間位阻對Fok1相互結合的影響，從而提高其打靶效率；dead SaCas9?Fok1系統需要配合2個21nt的Sa?sgRNA共同作用，Sa?sgRNA長于Sp?sgRNA(20nt)，且SaCas9識別的PAM序列為6nt，長于SpCas9的PAM(3nt)，所以當dead SaCas9?Fok1配合兩個Sa?sgRNA使用，進一步降低了脫靶效率。

技術領域

本發明涉及一種基因編輯系統，尤其是一種dead SaCas9-Fok1系統及其構建方法與應用。

背景技術

CRISPR基因編輯技術已經廣泛的應用于研究和生產中，是目前公認的第三代基因編輯技術(第一代，ZFN；第二代，TALEN；第三代，CRISPR)。相對于ZFN、TALEN等技術，CRISPR具有明顯的優勢，例如構建簡單、效率高使用成本低。根據細菌來源不同，目前已經研發出不同類型的CRISPR酶系統，例如SpCas9、SaCas9、NmCas9以及StCas9系統等，但所有的CRISPR系統均包含以下幾個部分，如圖1所示：1)PAM位點，位于靶序列的下游，只有幾個nt(例如，SpCas9/NGG；SaCas9/NNGRRT)，根據此位點來選取靶序列；2)sgRNA，識別并與切割位點結合的序列，一般在20nt左右；3)TracrRNA，連接于sgRNA之后的一段回文RNA序列；4)Cas9內切酶，含有2個獨特的活性位點，分別為在氨基末端的RuvC和蛋白質中部的HNH。CRISPR-Cas9基因編輯系統的工作原理見圖1所示，sgRNA、tracrRNA和Cas9組成復合體，識別并結合于sgRNA互補的序列，然后解開DNA雙鏈，形成R-loop，使sgRNA與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態，然后由Cas9中的HNH活性位點剪切sgRNA的互補DNA鏈，RuvC活性位點剪切非互補鏈，最終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。

CRISPR基因編輯具有以下特點：1、PAM序列一般只有幾個nt，統計發現其在基因組中出現的頻率很高，例如SpCas9/NGG在基因組中每35nt左右就會出現一次。2、sgRNA序列只有20nt左右，雖然使得我們在基因組中很容易選取靶向位點(針對相同長度的DNA序列，相對于ZFN、TALEN技術而言，CRISPR更容易選取到靶向位點)，但20nt左右的識別序列比較短，基因組中很容易出現相似的序列。綜上原因，CRISPR在科研上更具有廣泛的適用性。但站在應用的角度，CRISPR的缺點在于不僅可以切割靶向序列，同時也可能切割同源性較高的非靶向序列，即出現脫靶現象。此外還有研究發現，CRISPR能夠在一定程度上忍受sgRNA與靶位點的錯配，即靶向位點不需要完全與sgRNA序列配對，也可以被識別和切割，導致CRISPR可能出現更嚴重的脫靶現象。脫靶現象直接關系著CRISPR技術在臨床使用上的安全風險，嚴重阻礙了該技術往臨床應用方向的發展。