[發(fā)明專利]一種羊膜干細胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107653223A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭崇軍;周星;段中鑫;劉漢龍
• 申請（專利權(quán)）人: 江西瑞濟生物工程技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 南昌洪達專利事務(wù)所36111
• 代理人: 周超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種羊膜干細胞培養(yǎng)基及 其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

近些年來，再生醫(yī)學(xué)蓬勃發(fā)展，干細胞的研究取得了重大突破。使用干 細胞來生成機體組織和器官以替代人體喪失功能的器官和組織來達到治療目 的已逐步成為現(xiàn)實。干細胞很可能在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)革命性進步，因而具有不 可估量的醫(yī)學(xué)價值而引起全世界的廣泛關(guān)注和研究。是21世紀最具有發(fā)展和 應(yīng)用前景的領(lǐng)域。再生醫(yī)學(xué)需要具備三個必要的條件：(1)干細胞，即具有高 度的自我更新、增殖和分化能力，能夠修復(fù)受損器官組織的細胞；(2)支架， 支持細胞的生長；(3)生長和分化因子，促進細胞增殖和分化。其中干細胞起 著舉足輕重的作用，人們最早發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞是能夠無限增殖并且向三個胚 層分化，但是胚胎干細胞存在倫理問題。

人羊膜易于獲得，具有不引起倫理學(xué)爭議、所含羊膜干細胞(羊膜上皮 干細胞和羊膜間充質(zhì)干細胞)含量豐富、免疫原性低等特點，可成為再生醫(yī) 學(xué)臨床應(yīng)用的重要種子細胞來源。

目前，干細胞的常規(guī)培養(yǎng)體系中均加入了一定比例的胎牛血清進行培養(yǎng)， 存在異種免疫原性方面的實際問題，限制了臨床廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明提供一種羊膜干細胞培養(yǎng) 基，采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種羊膜干細胞培養(yǎng)基，包括如下組分：

優(yōu)選地，所述的羊膜干細胞培養(yǎng)基，包括如下組分：

優(yōu)選地，所述富血小板血漿來自用血細胞分離機直接采集的濃縮血小板 (機采血小板)、靜脈采集的全血(抗凝血)經(jīng)兩次離心法分離制備的血小板 濃縮液(富漿法手工血小板)或商業(yè)富血小板血漿。

本發(fā)明還提供一種羊膜干細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)人羊膜干細胞分離及單細胞懸液的制備

取人羊膜先用濃度3g/L胰蛋白酶，室溫消化30～60分鐘，共2～4次，然 后用V_DMEM∶VF₁₂＝1∶1的DMEM/F₁₂培養(yǎng)液中止胰蛋白酶，采用含加入濃 度為1.0～2.0g/L膠原酶IV和0.1～0.2g/L脫氧核糖核酸酶I的DMEM/F₁₂培養(yǎng) 液，37℃消化30～60分鐘，得到細胞懸液，過濾，制成單細胞懸液；

(2)人羊膜干細胞的培養(yǎng)、純化及擴增

將第(1)步所得細胞接種于培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為 5％的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并通過換液和傳代，使人羊膜干細胞逐漸得到 擴增和純化；

所述培養(yǎng)基采用前述的羊膜干細胞培養(yǎng)基；

在上述第(2)步中，將第(1)步所得細胞以1×10⁷L^-1～5×10⁸L^-1密度接種于培 養(yǎng)基中培養(yǎng)；

將細胞擴增和純化的過程如下：在第(2)步開始細胞培養(yǎng)后，培養(yǎng)48～72 小時，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞，根據(jù)細胞生長情況，2～3天全量換液 一次，待細胞達到80％～90％融合時，用終濃度3g/L胰蛋白酶消化，然后按 1∶2的比例或1∶3的比例進行傳代接種培養(yǎng)，并記為P1代，傳代培養(yǎng)過程 中每2～3天全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，重復(fù)上述操作進 行傳代培養(yǎng)，并記為P2代，繼續(xù)上述傳代培養(yǎng)過程。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：人羊膜是胎兒出生以后的 廢棄物，本發(fā)明從體外取人羊膜提取羊膜干細胞并進行培養(yǎng)，與用含有胎牛 血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細胞相比，具有無其他動物源性、來源廣 泛、不受倫理限制及無異種免疫原性等優(yōu)越性。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明一種羊膜干細胞凝膠作進一步的詳細說 明。

實施例1

一種羊膜干細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)人羊膜干細胞分離及單細胞懸液的制備

取人羊膜先用濃度3g/L胰蛋白酶，室溫消化30～60分鐘，共2～4次，然 后用V_DMEM∶VF₁₂＝1∶1的DMEM/F₁₂培養(yǎng)液中止胰蛋白酶，采用含加入濃 度為1.0～2.0g/L膠原酶IV和0.1～0.2g/L脫氧核糖核酸酶I的DMEM/F₁₂培養(yǎng) 液，37℃消化30～60分鐘，得到細胞懸液，過濾，制成單細胞懸液；