[發明專利]一種細胞培養收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法

在審

• 申請號: 201711080820.6
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107907470A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 袁冰;張智;李姣
• 申請（專利權）人: 武漢珈創生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 龔瑩瑩

1.一種細胞培養收獲液中病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，包括下述步驟：

1）預處理：按照常規離心方式去除待測樣品中的細胞碎片和雜質，經超速離心濃縮后的病毒，用MEM或PBS溶解；

2）上樣檢測：將經過步驟1）預處理的待測樣品與納米顆粒混合，將銅網置于該混合物中后超速離心；將銅網取出，清洗后的銅網磷鎢酸負染，電鏡觀察；

3）計數：若發現病毒樣顆粒，則對不同網格中的納米顆粒或病毒樣顆粒進行計數，每個網格至少觀察5個視野，結果中會給出網格中納米顆粒和病毒樣顆粒各自的數目，并根據兩者的比例關系計算出檢測樣品中病毒樣顆粒的濃度。

2.根據權利要去1所述的方法，所述的步驟1）的步驟包括：

1）、先取待檢測樣品5~10ml，轉入15ml離心管中，于4℃，3000g離心10分鐘；

2）、將離心好的上清轉入新的15ml離心管中，于4℃，6000g離心20分鐘；

3）、將離心好的上清轉入新的15ml離心管中，于4℃，10000g離心30分鐘，上清備用；

4）、取3~5ml備用上清置于超速離心管中，補滿離心管總體積6ml；在冷凍超速離心機中4℃，72000g離心2~4h；

5）、棄上清，每管加入500~1000ul無血清MEM培養基或PBS重懸，于冰上溶解4小時或過夜，收集樣品于1.5mlEP管中，凍于-80℃冰箱備用。

3.根據權利要求1所述的方法，所述的納米顆粒的直徑為100nm。

4.根據權利要求1所述的方法，步驟2）中超速離心的速度為100,000×g~120,000×g，離心時間為5~10分鐘。

5.根據權利要求1所述的方法，所述的磷鎢酸的濃度為3%。

6.根據權利要求1所述的方法，所述的銅網為200目。

7.根據權利要求1所述的方法，步驟2）中，待測樣品與納米顆粒混合時，待測樣品中的病毒數與納米顆粒的比值范圍是1：1~1：9。

8.根據權利要求1所述的方法，所述的納米顆粒的材質為合成乳膠。