[發明專利]新的模擬阿爾茨海默病的人誘導多潛能干細胞系及其用途

在審

• 申請號: 201711080459.7
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN108118069A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 閆玉波;付建;周敏;劉雨晴;江利香;楊波;楊佳銀
• 申請（專利權）人: 深圳市三啟生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 閆桑田

本發明涉及一種制備阿爾茨海默病(AD)的細胞模型的方法，其包括將AD相關基因整合到hiPSC中以誘導hiPSC的β?分泌酶水平增加和/或Aβ?42肽增加，同時還涉及由該方法制備的阿爾茨海默病(AD)的細胞模型。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，特別是為阿爾茨海默病(AD)創建生理學相關 的細胞模型。具體地，本發明涉及通過遺傳修飾人誘導多潛能干細胞(hiPSC) 制備AD細胞模型的方法。

背景技術

阿爾茨海默病(AD)是慢性神經退行性疾病，是癡呆癥的最常見原因。基 于雙胞胎和家庭的研究綜述，阿爾茨海默病的基因遺傳率范圍是從49％到 79％^1-2。大約0.1％的病例是家族性的常染色體(非性別連鎖)顯性遺傳，其在 65歲以前發病³。這種形式的疾病稱為早發性家族阿爾茨海默病。大多數常 染色體顯性家族性AD可歸因于以下三種基因之一的突變：編碼淀粉樣前體 蛋白(APP)以及早老素1和2的那些基因⁴。APP和早老素基因中的大部分 突變增加稱為Aβ42的小蛋白質的產生，Aβ42是老年斑的主要成分⁵。

阿爾茨海默病的大多數病例不表現為常染色體-顯性遺傳，其稱為散發 性AD，其中環境和遺傳差異可能是危險因素。最顯著的遺傳危險因素是載 脂蛋白E的ε4等位基因的遺傳(APOE)^6-7。40％至80％的患有AD的人至少 有一種APOEε4等位基因⁷。APOEε4等位基因將疾病的風險在雜合子中提 高三倍，在純合子中提高15倍³。

TREM2基因突變與高出3至5倍的阿爾茨海默病發生風險相關^8-9。普 通認可的作用機制是當TREM2突變時，大腦中的白細胞不再能夠控制β淀 粉樣蛋白的存在量。

AD具有兩個不同的特征：一個是存在含有淀粉樣蛋白β-蛋白(Aβ)的細 胞外噬斑，另一個是細胞內神經原纖維纏結(NFT)。雖然AD的真實病理仍 然不清楚，但數十年研究的積累為淀粉樣蛋白級聯假說提供了有力的證據。 根據這一假設，導致AD的關鍵事件似乎是在淀粉樣前體蛋白(APP)的加工 過程中形成特定的肽，其中淀粉樣蛋白β肽42(Aβ₄₂)是易于聚集形成Aβ₄₂寡聚體和隨后形成淀粉樣蛋白斑塊的粘性肽，這是AD的第一個特征。Aβ₄₂聚集體和淀粉樣蛋白斑塊的存在可以引發神經元的炎癥，并且增加鈣激活的 激酶的表達，其反過來誘導tau蛋白的過度磷酸化，tau蛋白穩定神經元中的 細胞骨架微管。tau蛋白的超磷酸化導致神經元中神經原纖維纏結的形成， 即AD的第二個特征，并且隨后導致神經元死亡^10-14。

三種酶，α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶參與APP的切割。在正常過程 中，APP首先被α-分泌酶或β-分泌酶切割，而γ-分泌酶將進一步切割的產 物加工成具有不同長度的肽的混合物。如果APP被β-分泌酶切割，則產物 將被γ-分泌酶進一步切割，以產生可溶性的40個氨基酸淀粉樣肽(Aβ₄₀)或 42個氨基酸的肽(Aβ₄₂)，所述42個氨基酸的肽聚集在一起形成不溶性聚集 體，因此形成淀粉樣斑塊。淀粉樣蛋白級聯假說的有力證據來自家族性AD(FAD)的研究，其顯示所有家族性AD患者的APP或早老素(PS)基因都具 有突變。APP基因突變導致異常的APP蛋白，所述異常的APP蛋白優先被 β-分泌酶切割產生更多的Aβ肽；而PS基因突變導致優先產生Aβ₄₂肽，Aβ₄₂肽為淀粉樣蛋白斑塊的成分。另一個重要的觀測結果是，AD患者中β-分泌 酶的表達和酶活性顯著升高，特別是在代表90％以上AD群體的散發性AD (SAD)患者中。受淀粉樣蛋白沉積影響的腦區域中β-分泌酶蛋白和活性水平 升高并且這種升高一直保持，但是AD中的神經元和突觸明顯丟失^15-17。