[發明專利]基于細胞結構張力變化的表皮可變色的熒光魚的生產方法

有效

• 申請號: 201711079996.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107828822B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 王雨軒;郭軍;生茂正;孔敏;馬佳蕊;邱珂;蔡雨婷
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027;C12N15/85
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種基于細胞結構張力變化的表皮可變色的熒光魚的生產方法，其特征在于，具體步驟如下：

步驟一：選用熒光蛋白對、細胞骨架蛋白、啟動子構建表皮可變色的熒光蛋白的重組轉座載體；所述細胞骨架蛋白為β-actin，所述熒光蛋白對為青色熒光蛋白和橙色熒光蛋白，所述啟動子為CMV IE真核啟動子；所述重組轉座載體為CMV IE真核啟動子-β-actin-eCFP-7aa-eYFP-β-actin-mini Tol2，其序列結構如SEQ ID NO:1所示；

步驟二：將重組轉座載體和Tol2mRNA共同注射入待處理魚種的單細胞期受精卵中，實現目的基因整合入基因組；

步驟三：篩選并鑒定出能夠穩定表達表皮可變色的熒光蛋白的魚種，以獲得在光誘導下細胞結構張力變化引起表皮可變色的熒光魚。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組轉座載體的構建過程如下：

1)將熒光蛋白、細胞骨架蛋白分別進行PCR擴增并酶切；

2)將載體、啟動子分別進行酶切；

3)步驟1)和步驟2)酶切片段混勻后進行多段連接形成重組轉座載體。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三獲得表皮可變色的熒光魚后還需進一步進行篩選得到純合體F3，具體步驟如下：將步驟三獲得的表皮可變色的熒光魚與野生型魚進行雜交，產生所述表皮可變色的熒光魚的雜合體F1，從雜合體F1中篩選出表皮表達可變色熒光蛋白的雜合體F1；

選取單個表皮表達可變色熒光蛋白的雜合體F1與野生型魚進行雜交產生所述表皮可變色的熒光魚的雜合體F2，從雜合體F2中篩選出表皮表達可變色熒光蛋白的雌魚和雄魚；

將篩選的雌魚和雄魚進行交配得到表皮可變色的熒光魚的純合體F3，從純合體F3中篩選出含有表皮可變色熒光蛋白的純合表皮可變色的熒光魚。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，還包括如下絕育步驟：通過溫度物理絕育處理法、靜水壓物理絕育處理法、電休克物理絕育處理法、細胞松弛素B化學絕育處理法、秋水仙素化學絕育處理法、聚乙二醇化學絕育處理法、或6-二甲基氨基嘌呤化學絕育處理法對純合表皮可變色的熒光魚的單細胞期受精卵進行處理，以獲得純合表皮可變色的熒光魚的四倍體；

將純合表皮可變色的熒光魚的二倍體和純合表皮可變色的熒光魚的四倍體進行雜交，以獲得純合表皮可變色的熒光魚的絕育的三倍體。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述溫度物理絕育處理法包括：將所述純合表皮可變色的熒光魚純合體的單細胞期受精卵置于42℃的養魚水中，熱激10分鐘。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括如下色素基因敲除步驟之一：

在所述步驟一之前，通過基因敲除技術對所述待處理魚種進行處理，敲除其中的魚體色素基因；或者在獲得所述表皮可變色的熒光魚之后，通過基因敲除技術對所述表皮可變色的熒光魚進行處理，敲除其中的魚體色素基因。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述待處理魚種為斑馬魚，被敲除的所述魚體色素基因是斑馬魚golden基因；

所述色素基因敲除步驟包括：在所述斑馬魚或所述可變色光誘導熒光觀賞魚的golden基因組外顯子區域中，尋找NGG的特征序列，其中緊鄰NGG之前20bp序列即為候選的目標序列；

將所述目標序列構建入pT7gRNA載體；

將含有所述目標序列的pT7gRNA載體與Cas9mRNA共同注射入所述斑馬魚的單細胞期受精卵或所述表皮可變色的熒光魚的單細胞期受精卵中，并將其培養成幼魚；

根據所述幼魚的魚體顏色的深淺篩選出色素基因敲除成功的幼魚作為之后繁殖的種魚，以制備出敲除了魚體色素基因的待處理魚種或生產出敲除了魚體色素基因的表皮可變色的熒光魚。

8.一種重組轉座載體，其特征在于，所述重組轉座載體為CMV IE真核啟動子-β-actin-eCFP-7aa-eYFP-β-actin-mini Tol2，其序列結構如SEQ ID NO:1所示。