[發明專利]一種A群輪狀病毒核酸檢測標準物質及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201711079594.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN108085411B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 徐蕾蕊;魏詠新;李丹;曾靜
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

1.一種A群輪狀病毒核酸檢測標準物質，其特征在于，所述標準物質的RNA序列如SEQID No.1所示，所述標準物質的特性值為（5.8±1.5）×10⁷拷貝/μL；其中，5.8×10⁷拷貝/μL為標準物質的標準值，而1.5×10⁷拷貝/μL為標準物質的不確定度；

且，通過以下方法制備獲得：

1）篩選A群輪狀病毒陽性樣品，提取病毒RNA，逆轉錄后，擴增出序列如SEQ ID No.5所示的DNA片段；擴增出序列如SEQ ID No.5所示的DNA片段所用的引物序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；

2）將步驟1）中所述DNA片段與質粒載體連接構建重組質粒；

3）將步驟2）獲得的重組質粒轉化到感受態細胞內，增殖，提取重組質粒；

4）采用限制性內切酶對步驟3）提取得到的重組質粒進行單酶切，得到線性化重組質粒；

5）以線性化重組質粒為模板，體外轉錄合成獲得A群輪狀病毒核酸檢測標準物質候選物，稀釋，然后采用RT-ddPCR方法，經均勻性、穩定性檢測后，進行定值和不確定度評估，即得；

其中，所述體外轉錄的啟動子為T7啟動子，其序列為SEQ ID No.6所示，轉錄是從序列最后三個G中的第一個G開始；

所述RT-ddPCR方法中，使用的引物序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，使用的探針序列如SEQ ID No.4所示，所述探針5’端標記FAM，3’端標記BHQ；

所述均勻性檢測具體方法為：應用不含RNase的DEPC處理水將制備的A群輪狀病毒核酸檢測標準物質候選物稀釋到10^-4，其紫外分光光度法測吸光度值A₂₆₀/A₂₈₀=2.07；通過對尖底離心管中部表層、中層、底層三個不同取樣點吸取30μL RNA溶液，采用qRT-PCR方法進行檢測，每個采樣點重復檢測5次，采用單因素方差分析方法比較不同采樣點的檢測Ct值；稀釋后的A群輪狀病毒核酸檢測標準物質候選物分裝入無菌無酶的1.2 mL有密封圈的螺口凍存管，每支0.1 mL，共制備200個樣品單元；按照分裝的初始、中前期、中后期和終結階段，將200個單元平均分為4層，每層50個單元，對每層內單元按1-50分別進行編碼，采用隨機數表決定每層抽取樣品的號碼，每層隨機抽取4個單元；采用RT-ddPCR方法進行均勻性檢測；

所述穩定性檢測包括短期穩定性檢測和長期穩定性檢測，具體方法為：短期穩定性：采用40℃、室溫、4℃和-20℃，考察A群輪狀病毒核酸標準物質樣品不同運輸條件下運輸過程中的穩定性；長期穩定性：將樣品保存在-80℃溫度下連續考察至少6個月；

所述定值和不確定度評估的具體方法為：采用RT-ddPCR進行多家實驗室合作定值的模式對制備的A群輪狀病毒核酸檢測標準物質進行定值，以含有A群輪狀病毒目的片段RNA的拷貝濃度，即每μL溶液中所含的RNA拷貝數作為標準值，5.8×10⁷拷貝/μL；不確定度來源包括三個方面：不均勻性引入的不確定度、不穩定性引入的不確定度和定值引入的不確定度，得到不確定度，然后根據置信概率95%，選擇擴展因子k=2，得到擴展不確定度為1.5×10⁷拷貝/μL；根據標準值及其不確定度，確定A群輪狀病毒核酸檢測標準物質的特性值為（5.8±1.5）×10⁷拷貝/μL。

2.一種包含權利要求1所述的A群輪狀病毒核酸檢測標準物質的試劑盒。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于檢測A群輪狀病毒核酸的RT-ddPCR引物和探針組合，所述RT-ddPCR引物和探針組合包含序列如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示的引物和序列如SEQ ID No.4所示的探針，所述探針5’端標記FAM，3’端標記BHQ。