[發明專利]一種維甲酸聯合卡介苗誘導HL-60細胞分化的方法

在審

• 申請號: 201711079189.8
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN109749995A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 昝秀芳
• 申請（專利權）人: 昝秀芳
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種維甲酸聯合卡介苗誘導HL?60細胞分化的方法，HL?60細胞株在完全培養基中培養，以GM?CSF、IL?4、TNF?α等共處理，只在實驗組加用卡介苗和ATRA。

技術領域

本發明涉及一種維甲酸聯合卡介苗誘導HL-60細胞分化的方法，具體地說是以一種維甲酸聯合卡介苗誘導HL-60細胞分化的方法。

背景技術

目前公知的樹突狀細胞（Dendriticcell，DC）是體內功能最強大的抗原遞呈細胞(APCs)，其能啟動自身特異性殺瘤免疫反應，但DC在人體內所占數量極微。目前，以末梢血中的單核細胞或CD34+細胞，可以誘導培養出大量DCs。國內外有大量實驗證明白血病細胞用經典的方法能被誘導成DC。但用經典的方法培養，HL-60細胞很難培養成樹突狀細胞。

發明內容

材料和方法 1、細胞和主要試劑；IL-12 ELISA為試劑盒為晶美生物公司產品，rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α為Bioscience公司產品，抗人CD1a-PE、CD1d-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE、HLA-DR-FITC單抗為Burlingame公司產品，ATRA為山東良福集團制藥有限公司產品，卡介苗（ BCGV）上海生物制品研究所。2、細胞培養；HL-60細胞在含體積分數為10%的小牛血清的RPMI-1640完全培養液中，在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中貼壁培養，隔日換液，根據細胞增殖密度進行傳代。3、實驗分組；調整細胞濃度為1×106/ml，分別接種于24孔培養板（1ml/孔）。ATRA溶解于無水乙醇。實驗組依需加入ATRA（終濃度為1×10-6 mol/L）、rhGM-CSF（終濃度為1000U/ml）、rhIL-4（終濃度為500U/ml）、卡介苗（終濃度為3×104cfu），在培養第8天時，加入100ng/ml的TNF-a，繼續培養72小時。對照組使用rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-a和無水乙醇作為對照。空白對照組僅使用rhGM-CSF及rhIL-4及TNF-a。4、DC的形態及表型檢測；倒置顯微鏡動態觀察細胞并攝片，將培育DC濃度調節為1×106/ml，取細胞懸液100μl/管，分別加入CD1a-PE、CD1d-PE、CD80-FITC、CD83-FITC、CD86-PE及HLA-DR-FITC單抗各15μl，混勻反應30min，流式細胞儀進行分析。5、IL-12測定；上清液IL-12水平測定，具體操作按ELISA試劑盒說明書進行。6、CCK-8法檢測混合淋巴細胞反應（MLR）；L-DCs用絲裂霉素(25μg／L)處理1h去增殖后作為刺激細胞，刺激健康自愿者外周血T細胞(DC：T細胞分別為1：100，1：50，1：10，1：1)與2×105個／ml的T細胞在96孔圓底培養板中作用5天。總體積為每孔200μl，對每個濃度均作3個平行孔，每孔加入CCK8（20μl/孔）在37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中培養4h，用酶標儀檢測波長450nm時的吸光度(A)值，參比波長為630nm，結果取均值。算刺激指數(SI)。SI=實驗孔的A值／對照孔的A值。統計學分析；采用SPSS16.0軟件，所測數據用均數±標準差（x-±s）表示，采用one-wayanalysisofvariance(ANOVA)統計方法分析分析。P<0.05表示有統計學意義。

結果；使用卡介苗和ATRA后獲得了具有較明顯樹突狀突起的細胞，DC表型CD83為(29.46±2.67)%、CD80為（65.23±4.65)%、CD86為(56±3.76)%、HLA-DR為(27.87±3.64)%及CD1d為(30.11±3.92)%，均明顯升高(p<0.05)，上清液IL-12水平為(182.44±11.96 pg/ml)，亦明顯升高(p<0.05)，并具有明顯的MLR反應。