[發(fā)明專利]一種表面修飾S?層蛋白的殼聚糖微球、制備及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711078216.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107899021A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 饒勝其;謝鑫;楊振泉;戴露婷;陳瑞;方維明
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: A61K47/69
• 分類號: A61K47/69;A61K47/62;A61K31/513;A23L33/195;A23L33/125;A23P10/20
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司32252
• 代理人: 戴朝榮,鄭慧娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及殼聚糖微球的制備領(lǐng)域，特別涉及一種S-層蛋白修飾殼聚糖微球的制備方法和應(yīng)用，具體為乳酸菌的S-層蛋白修飾的殼聚糖微球及其在功能性食品和藥品領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

殼聚糖是一種帶正電荷的天然多糖，無毒、無刺激性、無致敏性、無致突變作用、無溶血效應(yīng)，具有良好的生物相容性、生物降解性、生物黏附性和促進藥物吸收的作用。將殼聚糖制成載藥微球，能夠控制藥物釋放速度，降低藥物的毒副作用，提高疏水性藥物對細(xì)胞膜的通透性，改善藥物的穩(wěn)定性和改變給藥途徑，延長藥物療效以及靶向給藥等。近年來，已有多種藥物實現(xiàn)了殼聚糖微球作為緩釋控釋載體，并實現(xiàn)了在胃、結(jié)腸、肝、腎等部位給藥，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

乳酸桿菌S-層蛋白作為已知最小的S-層蛋白，可作為S-層蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究模型，其顯著的結(jié)晶特性、基因的可修飾性以及S-層晶格空間結(jié)構(gòu)特性，在生物技術(shù)、納米科技和生物醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用前景。乳酸桿菌作為益生菌，利用S-層蛋白的啟動子或基因序列進行外源蛋白的表達、抗原表位的展示等應(yīng)用，為生物安全基因工程疫苗的研究開辟了一條新途徑。此外，乳酸菌的S-層蛋白的生物拮抗作用備受人們的關(guān)注，但其機制還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種表面修飾S-層蛋白的殼聚糖微球、制備及應(yīng)用。通過S-層蛋白在殼聚糖表面修飾，不僅能夠使得殼聚糖微球在體內(nèi)作用更長時間，控制藥物釋放，同時利用S-層蛋白的益生功能，提高殼聚糖微球的功能特性。

本發(fā)明制備S-層蛋白殼聚糖微球的方法簡單、可行、質(zhì)量可控，且制備出來的S-層蛋白修飾殼聚糖微球的粒徑小，具有廣大的市場應(yīng)用價值。

為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種S-層蛋白修飾殼聚糖微球，所述殼聚糖微球是以殼聚糖為載體，戊二醛為 交聯(lián)劑，以Span-80為乳化劑，環(huán)己烷為油相，通過乳化交聯(lián)法制備的，并通過 乳酸菌S-層蛋白進行修飾，其中，S-層蛋白與殼聚糖微球的質(zhì)量比為1:1.2～1.9。

具體制備方法包括以下步驟：

（1）乳酸菌S-層蛋白提取：收集乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期的菌體，洗滌后與LiCl/GuHCl溶液先后混合孵育，離心收集上清后得S-層蛋白提取物；

（2）乳酸菌S-層蛋白純化：采用SP Sepharose(HP)柱對步驟（1）中S-層蛋白粗提物進行分離純化；

（3）乳酸菌S-層蛋白鑒定：采用MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定步驟（2）中純化后的S-層蛋白的序列；

（4）殼聚糖微球制備：將殼聚糖物質(zhì)加入適量體積及濃度醋酸溶液中，配置成殼聚糖溶液，按5-氟尿嘧啶與殼聚糖的質(zhì)量比稱取相應(yīng)質(zhì)量的5-氟尿嘧啶投放到上述醋酸溶液中，攪拌使其溶解后，慢慢加入到含有Span-80與環(huán)己烷的錐形瓶中，充分?jǐn)嚢韬螅S持一段時間，按比例加入戊二醛繼續(xù)反應(yīng)，分離產(chǎn)物，洗滌，冷凍干燥后，得到殼聚糖微球；

（5）乳酸菌S-層蛋白修飾殼聚糖微球：將步驟（2）中純化的S-層蛋白和步驟（4）中制備的殼聚糖微球分別溶于磷酸鹽緩沖液，兩者混合后在一定條件下孵育，離心棄去上清，得S-層蛋白修飾殼聚糖微球；

（6）S-層蛋白修飾殼聚糖微球性狀觀測：采用光學(xué)顯微鏡觀察形狀、大小和初步的分布，之后用激光粒度分析儀和掃描電鏡進行粒度分析；

（7）S-層蛋白修飾殼聚糖微球的體外釋放檢測：制備包埋5-氟尿嘧啶的S-層蛋白修飾殼聚糖微球，分別稱取適量的5-氟尿嘧啶粉末，殼聚糖微球和S-層蛋白修飾殼聚糖微球，置于含有5 mL的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄緩沖液的透析袋中，緊密封口，然后分別置于200 mL的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄緩沖液中，以100 r/min的速率恒溫震蕩，定時取5 mL的釋放介質(zhì)在265 nm測定其紫外吸光度，同時補充等量釋放液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，并繪制累計釋藥率-時間曲線。

優(yōu)選的，步驟（1）中所述乳酸菌為攜帶S-層蛋白的乳酸菌，包括嗜酸乳桿菌、布氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、短乳桿菌、開菲爾乳桿菌、卷曲乳桿菌的一種或多種。