[發明專利]一種家畜外周血來源巨噬細胞分離與培養的試劑盒

有效

• 申請號: 201711077978.8
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107630000B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 韓紅兵;劉永曉;劉哲熹;連正興
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;何葉喧

本發明公開了一種家畜外周血來源巨噬細胞分離與培養的試劑盒。本發明保護一種用于制備巨噬細胞的試劑盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴細胞分離液和巨噬細胞培養液。本發明通過血液密度梯度離心法將頸靜脈血、Hank，s溶液、人外周血淋巴細胞分離液(1:1:2均勻混合)的混合液離心，獲得外周血單個核細胞，經體外分離培養7?10天，從而獲得巨噬細胞。實驗證明，本發明試劑盒分離培養的巨噬細胞具有自發增殖和吞噬能力，可以經過20多次傳代培養，分離培養的巨噬細胞與傳統方法培育出的巨噬細胞在形態上一致；對巨噬細胞吞噬能力的鑒定與傳統方法培育出的細胞差別不大，本發明試劑盒制備簡單，成本低廉。

技術領域

本發明涉及一種家畜外周血來源巨噬細胞分離與培養的試劑盒。

背景技術

動物疫病的高發生率是當前畜牧業發展面臨的重大挑戰，據統計每年畜牧業總產值的12％至15％的損失是由畜禽疾病造成的。采用遺傳學方法從遺傳本質上提高動物機體免疫功能，增加動物對疾病的抗性具有治本的功效。隨著細胞分子生物學的發展，通過對免疫細胞的免疫機制進行研究，加快了動物抗病育種工作的進程。

巨噬細胞作為哺乳動物機體重要的免疫細胞之一，參與固有免疫反應，對病原微生物有吞噬消化功能，具有抗原加工呈遞作用，參與適應性免疫應答，在機體抵抗病原微生物入侵，衰老細胞清除，受損組織修復重建及促進炎癥反應過程中均發揮關鍵的作用。巨噬細胞分離培養技術的建立為機體相關免疫反應研究及胞內菌感染機制提供了重要的細胞材料。

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。

發明內容

本發明的目的是提供一種家畜外周血來源巨噬細胞分離與培養的試劑盒。

本發明提供了一種制備巨噬細胞的方法，包括如下步驟：

(1)以離體外周血為出發材料，獲得外周血單個核細胞；

(2)對步驟(1)得到的外周血單個核細胞進行培養，得到巨噬細胞。

所述步驟(2)中，采用巨噬細胞培養基對步驟(1)得到的外周血單個核細胞進行培養。

本發明還保護一種制備巨噬細胞的方法，包括如下步驟：

(a)將離體外周血、Hank's溶液和外周血淋巴細胞分離液混合，收集外周血單個核細胞；

(b)采用巨噬細胞培養液培養步驟(a)得到的外周血單個核細胞，得到巨噬細胞。

所述步驟(a)中，所述離體外周血、Hank's溶液和外周血淋巴細胞分離液的體積配比為1:1:2。

所述步驟(a)具體包括如下步驟：(1)將1體積份離體外周血和1體積份Hank's溶液均勻混合，得到混合溶液；(2)將1體積份步驟(1)得到的混合溶液加至1體積份外周血淋巴細胞分離液上面，分離得到外周血單個核細胞。

所述步驟(2)具體包括如下步驟：(I)將1體積份步驟(1)得到的混合溶液加至1體積份外周血淋巴細胞分離液上面，離心，將中間白色霧狀層細胞轉移至離心管中，離心，收集沉淀；(Ⅱ)采用Hank's溶液洗滌步驟(I)得到的沉淀(具體可為兩次)，離心，收集沉淀(即外周血單個核細胞)。

所述步驟(b)具體包括如下步驟：采用巨噬細胞培養液培養所述外周血單個核細胞24h，棄去懸浮細胞，PBS溶液洗滌貼壁細胞(具體可洗滌兩遍)，在巨噬細胞培養液中培養，每隔3-4天更換新的巨噬細胞培養液，連續培養7-10天，得到巨噬細胞。

本發明還保護以上任一所述的方法制備得到的巨噬細胞。

本發明還保護一種用于制備巨噬細胞的試劑盒，包括Hank's溶液、外周血淋巴細胞分離液和巨噬細胞培養液。