[發明專利]一種蔬菜接種發酵系統中發酵劑的定性和定量直接檢測方法

在審

• 申請號: 201711076468.9
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107779496A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 燕平梅;柴政;暢曉輝;趙文婧;陳燕飛;吳麗華
• 申請（專利權）人: 太原師范學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 太原晉科知識產權代理事務所(特殊普通合伙)14110
• 代理人: 王瑞玲,翟沖燕

1.一種蔬菜接種發酵系統中發酵劑的定性和定量直接檢測方法，其特征在于：提取蔬菜接種發酵系統中各個待測時間發酵液中微生物基因組總DNA，用16S rDNA V6-V8區通用引物進行PCR擴增，擴增產物與發酵劑的標準樣品以相同DNA含量上樣同步進行變性劑梯度凝膠電泳即DGGE電泳，通過標準樣品的DGGE電泳帶與擴增產物DGGE電泳帶的數量和遷移率比對分析得到定量檢測結果；通過凝膠分析軟件Quantity One定量分析功能計算標準樣品的DGGE電泳帶與擴增產物DGGE電泳帶的相對濃度，依據發酵劑標準樣品DGGE電泳帶的濃度得出蔬菜接種發酵體系中各個待測時間發酵劑的菌量，即獲得定量檢測結果，若待測時間發酵劑DGGE電泳帶與標準樣品DGGE電泳帶遷移率一致，相對濃度為1，則該發酵劑在蔬菜發酵系統成為主導菌，接種發酵工藝正常；相對濃度＞1，則該發酵劑在蔬菜發酵系統成為優勢菌，蔬菜接種發酵過程繼續；相對濃度<1，則該發酵劑在蔬菜發酵系統中未發揮其作用。

2.根據權利要求1所述的一種蔬菜接種發酵系統中發酵劑的定性和定量直接檢測方法，其特征在于：所述發酵劑標準樣品的制備方法為：a、發酵劑標準樣品菌種活化：2ml保存的發酵劑菌種接種到10ml的MRS液體培養基中30℃活化培養24h，將活化的菌種轉接到50 ml的MRS液體培養基中30℃下培養24h，再轉接到500ml的MRS液體培養基中30℃下培養24h進行擴大培養，然后將培養液在4000g離心機中離心5min沉淀富集菌種；富集的菌種用菌種體積4倍的生理鹽水清洗一次，最后用生理鹽水將清洗過的菌種稀釋至2×10⁸個/毫升，即用分光光度計測定650nm下通光率為20%；b、用稀釋好的菌液提取發酵劑標準樣品微生物基因組總DNA；c、用16S rDNA V6-V8區通用引物進行PCR擴增；d、取發酵劑標準樣品PCR產物50μl，-20℃保藏，使用前溶解于100μl TE緩沖溶液中制成標準樣品。

3.根據權利要求1或2所述的一種蔬菜接種發酵系統中發酵劑的定性和定量直接檢測方法，其特征在于：所述16S rDNA V6-V8區通用引物為：上游WBAC1引物堿基序列為：5ˊ-gtcgtcagctcgtgtcgtgaga-3ˊ，下游WBAC2-GC引物堿基序列為：5ˊ-cgcccgccgcgccccgcgcccggcccgccgcccccgcccccccgggaacgtattcaccgcg-3ˊ。