[發(fā)明專利]一種檢測蝦肉中的林可霉素的熒光分析法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711074479.3
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN109752352A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪霞;張淑雅;秦悅
• 申請（專利權(quán)）人: 鎮(zhèn)江華維檢測技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種檢測林可霉素的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析（TRFIR）技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明配制的試劑盒，采用TRFIR檢測林可霉素，測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。微孔板包被有LM－OVA，加入LM標(biāo)準(zhǔn)或樣品，再加入LM抗體。游離的LM與微孔板上的LM－OVA競爭LM抗體，沒有連接的LM抗體被洗滌除去，加入Eu^3＋－羊抗鼠抗體，標(biāo)記免疫反應(yīng)后沒有連接的Eu^3＋－羊抗鼠抗體被洗滌除去。加增強(qiáng)液后，用時間分辨熒光儀測定其熒光強(qiáng)度cps，熒光強(qiáng)度與樣品中的LM濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測樣品中LM的含量。本發(fā)明提供的檢測LM試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，使用方便、廉價、靈敏度高，操作時間大幅度減少；可用作檢測水產(chǎn)品(魚肉、蝦肉)中林可霉素殘留檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

一種檢測林可霉素(LM)的試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術(shù)領(lǐng)域， 用于魚、蝦等樣品中林可霉素的含量檢測。

背景技術(shù)

林可霉素是一種廣譜抗生素，常用于動物各種傳染病的治療，對于多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用。林可霉素存在嚴(yán)重的副作用，能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血等疾病，因此動物食品中的林可霉素殘留對人類的健康構(gòu)成巨大威脅。

目前有關(guān)動物源性食品中林可霉素及其代謝物的測定方法主要為理化檢測法，如用化學(xué)分析法測定蝦肉中 的林可霉素殘留量，檢出限為0.0125ug/kg，用高效液相色譜法測定魚肉中的林可霉素殘留量，檢出限為0.0125ug/kg。但這些方法儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，靈敏度低，且不適 用于大批量樣品的檢測，無法滿足國內(nèi)食品安全檢測市場的迫切需要。而時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA) 由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重 視和采用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測LM的試劑盒及其檢測方法，用于水產(chǎn)品樣品中林可霉素含量的檢測。本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測LM。技術(shù)方案：該檢測LM的 試劑盒是由：(1)96或48孔包被板；(2)緩沖液； (3)林可霉素標(biāo)準(zhǔn)；(4)林可霉素的抗體凍干品； (5)銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體；(6)洗滌液；(7)增強(qiáng)液所組成。

本發(fā)明測定方法：測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有LM-OVA的微孔板，加入LM標(biāo)準(zhǔn)或已處理好 的樣品到各自的微孔中，再加入LM抗體，振蕩反應(yīng)，游離的LM與微孔板上的LM-OVA競爭LM抗體， 洗滌液洗滌，沒有連接的LM抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu^3＋-羊抗鼠抗體，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，再 用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒有連接的Eu^3＋-羊抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強(qiáng)液振蕩后，在紫外光的 激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強(qiáng)度cps，熒光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比，對照標(biāo) 準(zhǔn)曲線即可確定樣品中抗原的量。

具體實施方案

實施例1

按下列步驟制備試劑盒和檢測蝦肉樣品：

(1)Eu^3＋-羊抗鼠抗體的制備：

取溶解于50mmol/LPBS pH7.0的5g/L羊抗鼠抗體1.2ml，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含 0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量 (1.46A280-0.74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L。取500-1000μl稀釋后的羊抗鼠抗體加入 含0.2-0.4mg的Eu^3＋-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu^3＋-DTTA)的小瓶中，30℃磁力攪拌反應(yīng) 20小時。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L Tris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)層析，A280 監(jiān)測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。