[發明專利]一種增加甲狀腺過氧化物酶表達量的表達方法

在審

• 申請號: 201711072129.3
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107841491A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 劉陽坤;姚倫廣;尹延震;王鐵軍;胡小敏;李娜
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08;C12N15/866;C12N15/65
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司11249
• 代理人: 姜司晨

1.一種增加甲狀腺過氧化物酶表達量的表達方法，其特征在于，是通過TC表達框對桿狀病毒轉移載體pFBDM-IG進行改造，通過提高細胞活率和延長蛋白表達時間來增加甲狀腺過氧化物酶在桿狀病毒表達系統中的表達量；所述TC表達框包括嵌合啟動子HPP和桿狀病毒反式激活因子IE0/1。

2.根據權利要求1所述的一種增加甲狀腺過氧化物酶表達量的表達方法，其特征在于，提高細胞活率是指利用極晚期啟動子polh驅動桿狀病毒反式激活因子IE0/1的表達。

3.根據權利要求1所述的一種增加甲狀腺過氧化物酶表達量的表達方法，其特征在于，延長蛋白表達時間是指利用嵌合啟動子HPP替換晚期啟動子p10來驅動甲狀腺過氧化物酶基因的表達。

4.根據權利要求1所述的一種增加甲狀腺過氧化物酶表達量的表達方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

1)TC表達框的構建：

利用融合PCR構建嵌合啟動子HPP，所述嵌合啟動子HPP包括轉錄增強序列hr1、桿狀病毒強啟動子p10和p6.9；利用PCR方法分別獲得IE0基因、IE1基因，然后以重疊PCR方法將IE0基因和IE1基因融合為IE0/1基因，利用常規酶切克隆方法將IE0/1基因克隆于pFBDM-IG轉移載體的polh啟動子下游，將嵌合啟動子替換p10啟動子，獲得含有TC表達框的桿狀病毒轉移載體pFBDM-TC-IG；

2)轉移載體pFBDM-TC-TPO-IG的構建：

將TPO-pMD19Tsimple載體和pFBDM-TC-IG載體分別用EcoRI和SalI進行酶切、膠回收、連接、轉化、酶切驗證和測序，得到正確的pFBDM-TC-TPO-IG；

3)Tn7位點的轉座：

制備AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受態細胞，加入5μL pFBDM-TC-TPO-IG質粒，冰浴30min，42℃熱激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培養基，32℃200rpm恒溫搖床上振蕩培養6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP/IPTG/X-gal的固體LB平板上，32℃培養箱中培養24～48h，直至出現藍白斑；挑取3～5個白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培養液中32℃220rpm振蕩培養，然后用TPO特異性引物進行菌液PCR驗證，驗證正確的菌液保存備用；

4)重組菌液感染Sf9細胞獲得重組桿狀病毒：

將構建的pFBDM-TC-TPO-IG/rSW106-inv+asd-重組菌液，按照以下方法感染Sf9細胞：用含8％FBS的Grace's培養基培養Sf9細胞于50mL培養瓶中，當細胞生長70％到80％單層之間，吹下細胞，鋪于24孔板中，28℃培養一夜；第二天用雙無培養基輕輕清洗3次，洗掉完全培養基；將鑒定正確的含有重組桿狀病毒穿梭質粒的大腸桿菌過夜培養后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5000rpm離心3min，倒掉上清，用PBS重懸菌體，5 000rpm離心3min，重復洗2次，倒掉上清，加入1mL雙無培養基，在另外的裝有500μL雙無培養基的1.5ml EP管里稀釋100倍、1 000倍；將稀釋成100倍、1 000倍的500μL菌液與雙無培養基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，將菌液與雙無培養基混合液吸出，加入500μL完全培養基；3d后觀察熒光檢測是否感染成功；將有熒光的細胞上清收集起來即為P1代重組病毒，將P1代重組病毒感染新的Sf9細胞得到P2代重組病毒；

5)甲狀腺過氧化物酶表達量的檢測：

收集病毒感染的Sf9細胞，離心收集上清，用RIPA細胞裂解液將細胞沉淀裂解，然后以細胞上清和細胞沉淀為樣品分別做ELISA檢測。

5.根據權利要求4所述的一種增加甲狀腺過氧化物酶表達量的表達方法，其特征在于，所述步驟1)中，pFBDM-IG轉移載體是在pFBDM原始載體的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因，IRES基因，即內部核糖體進入位點，介導核糖體與RNA結合，起始蛋白質翻譯；GFP基因表達產生綠色熒光蛋白，在病毒轉染和感染時起到報告基因的作用，IRES有助于GFP蛋白的表達。