[發明專利]用于檢測鴿TTV的EvaGreen實時熒光定量PCR引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201711069531.6
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107604098A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 萬春和;黃瑜;陳翠騰;程龍飛;傅光華;施少華;陳紅梅;傅秋玲;劉榮昌
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明提供用于檢測鴿TTV的EvaGreen實時熒光定量PCR引物及試劑盒，屬于動物傳染病學領域。

背景技術

實時熒光定量PCR方法（Real time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系。當前，實時熒光定量的在非特異性熒光標記中，熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，分別為：不飽和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和飽和染料（主要是EvaGreen）有兩種常用的熒光染料。前期研究發現，EvaGreen對實時熒光定量PCR的抑制性遠小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲線分析（HRM），該分析正被越來越多的用于實時熒光定量PCR后的基因分型和異源雙鏈分析。此外，EvaGree穩定性極強，且因其對細胞膜透性較低，而較SYBR GreenⅠ更加安全。

輸血傳播病毒，又稱Torque teno virus (TTV)，根據國際病毒分類委員會ICTV最新分類，將其歸類于指環病毒科(Anelloviridae)，α細環病毒屬(Alphatorquevirus)。TTV是一類無囊膜、單鏈環狀DNA病毒，研究發現不同種屬的TTV病毒基因組長短不一。人源TTV的基因組為3.2kb～3.9kb，豬和犬類的基因組為2.8kb左右，而貓科TTV的基因組約為2.1kb。對TTV的分析發現，TTV基因組有編碼區和非編碼區組成。一般認為，TTV包含有2個大的開放閱讀框（open reading frame，ORFs）：ORF1和ORF2，分別編碼復制相關蛋白（Rep）和抗原相關蛋白（Cap）。

鴿感染TTV最早于2013年報道（Zhang Z, Zhuang L, Dai W, Mao H, Dai D. Complete genome sequence of a novel pigeon torque teno virus in China. Genome Announc, 2013, 1(6). pii: e01076-13.）。目前，由于鴿TTV無法分離培養，關于鴿TTV致病力、致病機理、分子流行病學調查等相關研究還未見涉及。建立能夠對鴿群鴿TTV的實時熒光定量PCR檢測方法，可有效用于對鴿群中流行的鴿TTV病原進行檢測。但是，當前國內外尚未見基于飽和熒光染料Eva Green可對鴿TTV進行檢測實時熒光定量PCR檢測方法的引物研究報道，本發明的建立可填補國內外相關領域研究空白。

發明內容

本發明提供用于檢測鴿TTV的EvaGreen實時熒光定量PCR引物及試劑盒, 建立能夠對鴿群中鴿TTV檢測的EvaGreen實時熒光定量PCR方法，簡化操作程序、節約成本。

為實現上述目的，采用以下技術方案：

鴿TTV EvaGreen實時熒光定量PCR檢測引物，包括如下：

上游引物PiTTV-SYF1：5’- TTATGAGACGGCAGCTCTGGC -3’，

下游引物PiTTV-SYR1：5’- GCTGTGCTCTCTACCCATCCAGTC -3’，

目的片段大小為132 bp。

用于檢測鴿TTV EvaGreen實時熒光定量PCR方法的試劑盒，包括以上所述的引物。

實時熒光定量PCR反應體系（20 μL）為：Eva Green Mix混合液10.0 μL、上/下游引物（PiTTV-SYF1和PiTTV-SYR1）（10 μmol/L）各0.2 μL、模板2 μL、用滅菌雙蒸水補足至20 μL。最佳反應條件為：95℃ 1 min預變性；95℃ 10 s、62℃ 20s，共40個循環。反應結束后，做出溶解曲線。

結果判斷：

實時EvaGreen熒光定量PCR反應結束后，觀察溶解曲線峰值（Tm值）分析試驗結果：若在Tm=（86.02±0.18）℃出現單一的特異性峰判為鴿TTV陽性。

本發明提供檢測鴿TTV EvaGreen實時熒光定量PCR檢測引物及試劑盒，具有以下優點和效果：